犬莱姆病诊断方法的建立及应用

发布时间：2020-03-25 19:39

【摘要】：莱姆病(Lyme disease)是由媒介蜱传播的伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi sensu lato)感染所引起的一种自然疫源性疾病,是由虫媒介蜱传播的人兽共患病,该病发生和流行的时间与蜱虫活跃时间一致。莱姆病对人类、动物的健康构成了严重的危害,主要波及野生动物及宠物的健康养殖,已成为全球严峻的公共卫生问题。1986年,自艾承绪等首次在黑龙江省海林县发现本病以来,我国目前已有30个省(市、区)经确认为莱姆病自然疫源地,主要分布在华北、西北和东北林区,分布呈现地域聚集的趋势,该病的发生依赖于其媒介蜱以及宿主动物的分布,但由于蜱虫叮咬时无痛感,且该病的早期症状不明显,常与风湿性关节炎等疾病、发烧等现象混淆导致错过最佳治疗时间。早在1993年,于美国纽约25个城镇采集的1446份犬血液样本中,犬莱姆病阳性率介于6.5%至85.2%之间。该数据表明由于人类与宠物犬关系密切,导致人感染莱姆病的机率增加。随着我国经济快速发展与人民生活水平的提高,宠物逐渐成为了人们生活中不可或缺的一部分。然而,我国对于犬莱姆病的血清学检测方法尚未报道,因此建立快速准确的犬莱姆病诊断方法迫在眉睫。本研究在国家十三五重点研发项目“宠物细菌与真菌传染病诊疗与防控新技术研究”(项目编号:2016YFD0501005)支持下,建立伯氏疏螺旋体SYBR Green I荧光定量PCR方法和犬莱姆病间接ELISA诊断方法,为宠物与人类的健康安全提供技术支持与保障。主要研究内容如下:I.伯氏疏螺旋体SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立本研究基于国内外主要流行的伯氏疏螺旋体菌株的3个基因型:嘎氏疏螺旋体(B.garinii)、阿氏疏螺旋体(B.afzelii)、狭义伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi sensu stricto)中的16S rRNA基因片段为模板,针对伯氏疏螺旋体的保守区域设计Real-time PCR特异性引物,建立荧光定量方法。其中该方法标准曲线的相对系数R~2为0.99,扩增效率为98.217%。特异性试验结果表明,所建立的方法只特异的检测出伯氏疏螺旋体,而与其它病原无交叉反应。敏感性试验结果表明此方法比普通PCR灵敏10~4倍,能够检测到的最小拷贝数为4.72 copies/μL。应用该方法对采自吉林省四平市的25只蜱虫样本进行检测,样品阳性率为40.00%。II.伯氏疏螺旋体OspC的克隆表达及抗原性分析选取伯氏疏螺旋体外膜蛋白C(OspC),经过生物信息学分析,利用原核表达载体对B31菌株的OspC基因进行表达、纯化和Western-blot分析,表明该蛋白具有良好的免疫原性。III.犬莱姆病间接ELISA诊断方法的建立与应用本研究建立了一种用于犬莱姆病诊断和血清流行病学调查的ELISA方法。以OspC蛋白为包被抗原,建立了用于犬莱姆病抗体检测的间接ELISA方法。应用该方法对所采集到的309份犬血清临床样品进行应用检测,平均抗体阳性率达20.71%。结果表明本研究所建立的ELISA方法可用于临床血清样本的检测,检测结果说明莱姆病在我国的犬群中感染率较高。
【图文】：

电泳图,电泳图,片段,基因扩增

图 1.1 PCR 扩增电泳图Fig.1.1 PCR amplification electrophoresisM：DNA 分子质量标准；1-3 16S rRNA 基因扩增产物M：2000bp DNA Marker；1-3：PCR products of 16S rRNA质粒 PCR 鉴定5.2 方法，对重组菌进行 PCR 鉴定，目的片段为 13片段克隆入 pEASY-T1 连接载体，测序结果显示 T

电泳图,产物,基因扩增,对重

图 1.1 PCR 扩增电泳图Fig.1.1 PCR amplification electrophoresisM：DNA 分子质量标准；1-3 16S rRNA 基因扩增产物：2000bp DNA Marker；1-3：PCR products of 16S rRN粒 PCR 鉴定方法，对重组菌进行 PCR 鉴定，，目的片段为段克隆入 pEASY-T1 连接载体，测序结果显示
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.292

【参考文献】