番鸭NPY、SMAD3基因克

发布时间：2020-03-25 20:10

【摘要】：番鸭作为国内外优良的肉用鸭种之一,其具有生长快、易饲养、抗病性强、产肉率高且具有特殊珍禽野味、产肥肝性能好、饲料报酬高等诸多优点而深受广大养殖户和消费者的青睐,市场饲养前景较好。而相较于家鸭,母番鸭育成时间长、年产蛋量低、就巢性强等缺点导致其繁殖性能较低,且饲养成本增加,严重制约了番鸭集约化、规模化饲养的发展。番鸭的繁殖性能的选种、选育迫在眉睫,而常规育种手段很难对繁殖性能做出精确选择,而分子标记育种技术可精确快速的辅助选种选育。寻找与番鸭繁殖性状相关候选基因作遗传分析,找出相关分子标记,为番鸭繁殖性状的选种选育提供分子依据,本实验以番鸭为实验动物,选取番鸭繁殖性能候选基因NPY、SMAD3两个基因,克隆获得NPY、SMAD3两个基因的全长编码区后进行其同源性以及遗传进化关系等生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR技术,分析NPY、SMAD3基因在产蛋期不同组织中的分布规律;对NPY、SMAD3两个基因进行SNP位点筛查,并分析了这些多态位点与番鸭产蛋性能的相关性。结果如下:1.成功克隆了番鸭NPY基因的全长编码区294 bp,共编码97个氨基酸,同源性对比显示,NPY基因核苷酸序列与绿头鸭同源性最高,为99.7%,其次是火鸡,同源性为97.3%;NPY蛋白氨基酸序列与绿头鸭、火鸡相似性一致,同源性为100%,其次是原鸡(99%),表明NPY基因在以上鸟类中具有较高的保守性;遗传进化树结果表明番鸭与绿头鸭的亲缘关系最近;NPY蛋白特征分析结果表明,NPY蛋白为酸性且不稳定,存在一个信号肽(第1位氨基酸至第28位氨基酸),细胞亚定位为100%位于细胞外;存在1个PAH的功能结构域,同时含有2个O-糖基化以及丰富的磷酸化位点,空间结构主要以α-螺旋和无规则卷曲占优,该结果可为深入研究番鸭NPY基因的结构与功能提供一定的参考资料。2.成功克隆获得了番鸭SMAD3基因的CDS区全长966 bp,编码321个氨基酸,同源性对比显示,番鸭SMAD3基因CDS区核苷酸序列与绿头鸭同源性最高,为99.8%,其次是鸿雁,同源性为99%;除美洲雕外,番鸭SMAD3基因氨基酸序列与绿头鸭等鸟类的同源性为100%,氨基酸相似性完全匹配;与长江江豚等哺乳动物以及斑马鱼的同源性均为96.6%以上,表明NPY基因在以上物种中具有较高的保守性,遗传进化树结果表明番鸭与绿头鸭的亲缘关系最近;SMAD3蛋白特征分析结果表明,SMAD3蛋白为酸性且不稳定,无信号肽,细胞亚定位主要位于细胞质中的细胞器内;存在MH1、MH2两个功能结构域,同时富含糖基化和磷酸化位点,空间结构以无规则卷曲占优,该结果可为深入研究番鸭SMAD3基因的结构与功能提供一定的参考资料。3.Q-PCR结果表明,NPY基因mRNA在番鸭各组织中均有表达,其中在大脑中表达水平相对较高,胰腺、腺胃表达量次之,差异极显著(P0.01),肌胃中表达量最低。SMAD3基因mRNA在各组织中均有分布,其中在肌肉组织中相对表达水平较高,子宫表达量次之,差异极显著(P0.01),肌胃中表达量最低。4.在NPY基因的5’端启动子区中发现位于A-411G、A-540G的2个SNPs位点,存在AA、AG、GG三种基因型,与产蛋性能相关性分析后发现,AG型番鸭群体开产早于AA、GG基因型群体,差异极显著(P0.01),GG基因型群体的开产蛋重显著高于AA基因型群体(P0.05),AG基因型群体300日龄总产蛋量显著高于AA基因型群体(P0.05)。结果表明,在A-411G、A-540G两个位点的优势突变基因型可能是潜在的番鸭繁殖性能的分子标记。5.在番鸭SMAD3基因的外显子序列中共发现15个SNPs突变位点,与产蛋性能相关性分析后发现,A+6185G位点的AA基因型、G+6269T位点的AA基因型、C+24204T位点的CC基因型、A+27515G位点的AG基因型与开产日龄呈极显著相关(P0.01或P0.05),C+24204T位点的CC基因型、A+27515G位点的AG基因型、A+27541G位点的AG基因型与300日龄总产蛋量呈极显著或显著相关(P0.01或P0.05),C+27350G突变位点中的CG基因型群体平均开产蛋重显著高于GG基因型(P0.05),C+24295T突变位点中,TT基因型开产蛋重显著高于CT基因型群体(P0.05),C+27535T突变位点中,CC基因型群体的开产蛋重显著高于CT基因型群体(P0.05)。表明上述SNPs突变位点优势基因型可能是番鸭繁殖性能的潜在分子标记,可用于提高番鸭产蛋性能的分子标记辅助选择。
【图文】：

18S 条带明亮、清晰，且 28S 条带亮度约为 18S 条带的两倍，说明所抽提的组织总 RNA 结构比较完整，质量较好，未发生明显的降解，可用于下一步实验。图.2-1 番鸭不同组织总 RNA 电泳检测Fig.2-1 Detection of total RNA extracted from different tissues of Muscovy Duck3.2 番鸭 NPY 基因 CDS 区克隆番鸭组织样混合 cDNA 经 NPY 克隆引物 PCR 扩增后，产物经 1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，出现了大约为 294 bp 的目的片段(如图 2-2 A），切胶回收后克隆于 pEASY-T5 Zero Cloning Kit 载体上，经菌液 PCR 筛选阳性菌液(如图 2-2 B)，测序后获得长度为 294 bp 的开放阅读框（Open Reading Frame,ORF），包括起

(A) (B)图 2-2 NPY 基因 CDS 区 PCR 扩增（A）与阳性质粒鉴定（B）；M.MarkerFig.2-2 PCR amplification of CDS region of NPY gene (A) and identification of NPY gene posplasmid (B).3.3 番鸭 SMAD3 基因 CDS 区克隆番鸭组织样混合 cDNA 经 SMAD3 分段引物 PCR 扩增后，产物经 1.5%的琼凝胶电泳检测，分别出现了大约为 634bp、524 bp 的目的片段(如图 2-3 A/切胶回收后克隆于 pEASY-T5 Zero Cloning Kit 载体上，经菌液 PCR 扩增后检测挑选阳性菌液(如图 2-3 C/D)，阳性菌液测序拼接后获得片段长度为 96的开放阅读框（Open Reading Frame，ORF），包括起始密码子 ATG，终止子 TAA，且该片段与 NCBI 数据库中 Genbank 上所公布的绿头野鸭 SMAD3 基mRNA 序列（登录号：XM_005030067.3）大小一致，表明克隆获得的目的片SMAD3 基因完整的 CDS 区序列。
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S834.2

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本文编号：2600384