IGF2基因来源的IGF2 AS和miR-483调控牛骨骼肌细胞增殖分化机制研究

发布时间：2020-03-25 21:51

【摘要】：骨骼肌是畜禽肉类食品的重要组成部分,其肌纤维类型组成是影响肉品质的重要因素。因此,研究骨骼肌发育对于如何提高肉产量以及改善肉品质具有一定的指导意义。至今,有关骨骼肌形成过程的研究已有大量的报道。骨骼肌发育始于胚胎期,由中胚层的体节迁移出Pax3~+/Pax7~+肌源性祖细胞,由生肌调节因子Myf5、MyoD以及MRF4参与调控的成肌定向分化,肌细胞进一步经过增殖、分化融合形成肌纤维;在出生后,肌纤维数目基本确定,肌肉量的增加主要依赖肌纤维的增长和增粗。当骨骼肌受到损伤刺激或者运动时,骨骼肌具备再生修复能力,而这种能力主要依靠肌源性干细胞(卫星细胞,Pax7~+/Myf5~-)的激活,激活后的卫星细胞(Pax7~+/Myf5~+)可以向成肌进行分化,融合形成新的肌纤维,达到修复受伤肌纤维的目的。无论是胚胎阶段的骨骼肌形成,还是出生后骨骼肌的生长甚至损伤后的再生修复过程,除受到Pax3/Pax7,MRFs的调控外,还受到MEF2家族成员,Wnt等信号分子,IGFs等生长因子以及非编码RNA的调控。近年来,有关非编码RNA调控骨骼肌的发育的研究备受关注,其重要性不容忽视。本论文的研究重点在于运用高通量测序技术筛选秦川牛不同发育阶段(胚胎期、出生期以及成年阶段)骨骼肌差异表达的非编码RNA(lncRNAs和miRNAs),通过5’RACE和3’RACE、RT-qPCR、FISH、RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)、RNA pull down、流式细胞术等技术,系统阐释源于生长因子IGF2基因内含子区域的非编码RNA IGF2 AS和miR-483在牛骨骼肌发育中的功能和分子机制。主要研究结果如下:1、肌肉组织中lncRNAs的筛选、鉴定及表达特征分析本研究在实验室前期秦川牛不同发育阶段(胚胎期、出生后和成年阶段)骨骼肌lncRNA高通量测序的基础之上,进一步对已筛选的401个差异表达的lncRNA进行挖掘鉴定分析。发现在生长因子IGF2基因内含子区域存在一个反义转录本,将其命名为IGF2 antisense transcript(IGF2 AS)。通过cDNA末端快速扩增(RACE),发现此转录本由698个核苷酸的单外显子组成。经蛋白编码潜能软件CPC预测分析发现,IGF2AS的编码能力较弱,属于非编码RNA。高通量测序结果和RT-qPCR验证结果都证实,IGF2 AS主要在胚胎阶段的骨骼肌中表达。在牛骨骼肌细胞生长阶段,IGF2 AS表达量相对较高;在分化时期,IGF2 AS的表达呈现出上升的趋势。2、IGF2 AS调控牛骨骼肌细胞增殖、分化和凋亡的功能研究运用RT-qPCR、Western blot、流式细胞术、EdU、CCK8、RNA-seq、细胞免疫荧光等试验揭示IGF2 AS在牛骨骼肌发育过程中的功能。在牛骨骼肌细胞增殖阶段,干扰IGF2 AS表达抑制细胞增殖关键基因的表达水平,导致G_1期细胞数目增加,S期细胞减少,细胞增殖活性下降,而过表达IGF2 AS后结果与之相反;在牛骨骼肌细胞分化阶段,干扰IGF2 AS抑制生肌调控因子的表达水平,MyHC阳性肌管的数目减少,而过表达IGF2 AS后结果与之相反;另外,干扰IGF2 AS导致牛骨骼肌细胞生长阶段凋亡细胞数目的增加,而过表达IGF2 AS抑制牛骨骼肌细胞的凋亡。3、IGF2 AS调控牛骨骼肌细胞增殖、分化和凋亡的机制研究RNA核质分离和荧光原位杂交实验结果表明,IGF2 AS在牛骨骼肌细胞的细胞质和细胞核中都表达。经DNaseⅠ和RNase A处理细胞总RNA后,PCR检测结果表明IGF2AS与IGF2 mRNA的前体序列可形成互补双链结构。放线菌素D处理生长阶段的牛骨骼肌细胞发现,IGF2 AS的表达能够稳定IGF2不同转录本的表达。RIP分析结果表明,Ago-2蛋白质可与IGF2 AS结合,推测IGF2 AS具有竞争性内源RNA的潜质。双荧光素酶报告分析结果表明,miR-221/miR-222与IGF2 AS存在竞争性结合关系,进一步的功能验证结果表明过表达IGF2 AS能够恢复miR-221/miR-222靶基因MyoD的表达。RNA pull down、蛋白质谱以及RIP检测结果表明,蛋白质ILF3可与IGF2 AS结合。IGF2AS正调控ILF3的表达,干扰ILF3后抑制牛骨骼肌细胞增殖和分化,促进牛骨骼肌细胞凋亡。4、miR-483通过IGF1/PI3K/Akt信号通路调控牛骨骼肌细胞增殖和分化MicroRNA高通量测序分析结果表明,位于IGF2基因内含子区域的miR-483在不同发育阶段的骨骼肌中差异表达,且在胚胎期表达量较高。功能研究结果表明,过表达miR-483抑制牛骨骼肌细胞的增殖和分化,干扰miR-483促进牛骨骼肌细胞的增殖和分化。机制研究表明,IGF1是miR-483的一个靶基因,并且miR-483可以通过下调IGF1的表达,影响PI3K/Akt信号通路关键蛋白的表达。本研究借助高通量测序技术筛选差异表达的lncRNA和microRNA,阐明lncRNA和microRNA在牛骨骼肌发育过程中的功能和作用机制,为研究非编码RNA调控牛骨骼肌发育提供理论基础。
【图文】：

生肌调节因子,蛋白质结构

Shh、BMP 和 Notch 等，以及生长因子 TGF-β、FGFs 和 IGFs 等的影响。另外，非编码 RNA（miRNA 和 lncRNA）也广泛参与调控骨骼肌发育过程。出生后，肌肉量的增加主要依赖于骨骼肌纤维的增长和增粗，这得益于肌源性干细胞（卫星细胞）的存在。骨骼肌是可以再生的，这种能力正是由卫星细胞所赋予的在正常状态下，卫星细胞处于静息状态，当骨骼肌运动或受到损伤刺激时，卫星细胞由静息状态变成激活状态，定向分化成成肌细胞，经过增殖、分化融合形成肌管修复受伤的肌纤维，从而达到修复损伤骨骼肌的目的。整个过程也受到上述 Pax3/Pax7、MRFs、MEF2、信号分子、生长因子以及非编码 RNA 等因素的调控。骨骼肌损伤再生修复过程类似于胚胎阶段骨骼肌发育，这为在体研究骨骼肌发育过程提供了有利条件1.1.1 生肌调控因子在骨骼肌形成过程中的作用生肌调控因子（MRFs）由 MyoD、Myf5、myogenin 和 MRF4 四个成员组成，都具备基本的螺旋-环-螺旋结构，蛋白结构上具有一定的相似性（图 1-1）。在胚胎阶段骨骼肌生成和出生后骨骼肌发育的过程中，MRFs 参与调控骨骼肌的定向和分化(Hernandez-Hernandez et al. 2017)。通过调节肌节和肌肉特异性基因的活化以促进细胞分化和肌节的组装，它们在多个点起协同作用以建立骨骼肌表型。

富集,调控研究,动物骨骼,成肌细胞

第一章动物骨骼肌发育及其非编码 RNA 调控研究进展in 下调，说明在分化过程中 myogenin 作为重要的细胞周期退出调节因MyoD 能够促进生长成肌细胞的增殖(Cao et al. 2006)。在 C2C12 成肌eq 实验证明，MyoD 和 Myf5 之间的差异依赖于转录活性而不是整个基点的偏好，只有 MyoD 能够富集 RNA polⅡ并激活靶基因的转录，而 M蛋白 H4 乙酰化修饰染色体却不能富集 RNA polⅡ，从而造成二者在调( Hernandez-Hernandez et al. 2017; Cao et al. 2010)。由此可见，MRFs 调仅有来自上游调控因子的参与，，其涉及调控的下游靶基因更是复杂多样
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S823

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