乳酸杆菌减轻大肠杆菌诱发奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤的机理
发布时间：2020-03-25 22:19
【摘要】：大肠杆菌(Escherichia coli,Ecoli)是引起奶牛乳房炎的主要环境致病菌,导致乳腺组织损伤及细胞死亡。目前,抗生素是防治奶牛乳房炎的主要手段,但抗生素过度使用带来严重的食品卫生安全、抗生素耐药性扩散及环境污染问题。益生菌作为潜在的抗生素替代品,在防治大肠杆菌性奶牛乳房炎方面具有重要作用。本研究使用大肠杆菌感染奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)体外模型,探究益生菌鼠李糖乳酸杆菌GR-1(Lactobacillus rhamnosusGR-1,LGR-1)减轻大肠杆菌引起的奶牛乳腺上皮细胞炎性反应及细胞损伤的分子机制。使用组织贴块法及差速离心法,从健康奶牛乳腺分离得到纯化的原代奶牛乳腺上皮细胞,cytokeratin18染色表明,BMECs具有明显的上皮细胞特征。BMECs提前3h孵育LGR-1(1 × 107 CFU/ml),然后感染E.coli(1× 107CFU/ml)。结果发现,活的及紫外灭活的LGR-1抑制了E.coli在BMECs黏附。E.coli感染后,Toll-like receptor 4(TLR4),NOD1及NOD2 mRNA表达明显升高,然而预孵育LGR-1减弱了上述因子的高表达。免疫荧光及Western blot结果表明,预孵育LGR-1降低了E.coli引起的NLRP3(NOD-like receptor family member pyrin domain-containing protein 3)及caspase-1 高表达。然而,E.coli感染后,接头蛋白ASC(apoptosis-associatedspeck-likeprotein)表达明显降低。预孵育LGR-1抑制了E.coli引起的白介素interleukin(IL)1β、-6、-8、-18及肿瘤坏死因子α mRNA的高表达,但上调了IL-10 mRNA表达。本部分结果表明,LGR-1降低了E.coli黏附,进一步通过促进TLR2表达,抑制了TLR4,NOD1及NOD2的表达及减弱ASC非依赖性的NLRP3炎性体激活,减弱E.coli引起的细胞形态学及超微结构损伤,并限制E.coli 引起的致死性炎性反应。为了进一步确定ASC蛋白在LGR-1抗 E.coli感染中的作用,使用clustered,regularly interspaced,short palindromic repeat(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)-9技术敲除奶牛乳腺上皮MAC-T细胞ASC基因。MAC-T细胞提前3 h孵育LGR-1(1 × 107 CFU/ml),然后感染E.coli(1 × 107CFU/ml)。Western blot结果表明,E.coli感染后,NLRP3及NLRC4的表达升高,预孵育LGR-1降低了E.coli引起的两种受体的高表达,在敲除ASC基因的细胞中也有这种变化。免疫荧光及Western blot结果表明,E.coli感染6 h,预孵育LGR-1降低了E.coli引起的caspase-1激活,在ASC敲除细胞中也能观察到。LGR-1抑制了E.coli引起的caspase-4激活。ASC敲除降低了细胞中IL-1β及IL-18的表达,但没有完全阻止大肠杆菌引起的IL-1β及IL-18高表达及细胞焦亡,然而预孵育LGR-1抑制了这种增加。本研究表明,在E.coli感染中,LGR-1抑制了ASC依赖性的NLRP3及NLRC4炎性体激活,及下游IL-1β及IL-18的产生。LGR-1抑制了E.coli引起的细胞焦亡,部分是通过减弱ASC非依赖性的NLRC4及非经典的caspase-4激活。本研究加深了对益生菌作用分子机制的理解,为益生菌防治奶牛乳腺致病菌感染提供了科学理论支撑。
【图文】：
图邋１－３邋ＭＰＥＣ邋对乳腺的损伤（引自邋Ｓｈｐｉｇｅｌ邋Ｎ？以邋ｇ／．，Ｑｐ／ｍｏ／ｉ邋／？Ｍ／ｃｒｏ办／ｏ／＜９ｇｙ，邋２００８，邋１１：邋６０－６５）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－３邋ＭＰＥＣ邋ｉｎｄｕｃｅ邋ｄａｍａｇｅ邋ｏｆ邋ｍａｍｍａｒｙ邋ｇｌａｎｄ邋（Ｓｈｐｉｇｅｌ邋Ｎ．邋ｅｔ邋ａｌ．．邋Ｃｕｒｒｅｎｔ邋Ｏｐｉｎｉｏｎ邋ｉｎ邋Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．邋２００８．邋１１：逡逑６０－６５）逡逑４逡逑
２．２结果逡逑２．２．１乳腺组织切片观察逡逑通过对健康奶牛与乳房炎发病奶牛乳腺病理图片观察（图２－１），可见健康泌乳期奶牛乳腺逡逑组织间质结构正常，腺泡中乳样分泌物充盈，乳脂含景高（可见脂滴）（图２－１Ａ）；健康非泌乳逡逑期奶牛乳腺腺泡结构较完整，腺泡中乳汁样分泌物较少（图２－１Ｂ）；临床乳房炎症状较轻的奶牛逡逑乳腺腺泡组织较完整，腺泡内有炎性细胞浸润（图２－１Ｃ）；临床乳房炎奶牛乳腺腺泡中有炎性细逡逑胞浸润，偶见乳腺腺泡间质内有淋巴细胞，腺泡中可见散在的嗜酸性粒细胞，，乳腺腺泡腔内有深逡逑染的乳样分泌物（图２－１Ｄ）；严重临床乳房炎的乳腺切片可见乳腺硬化，纤维结缔组织增生，正逡逑常乳腺的腺泡组织消失，取而代之的是大景结缔组织，整个组织呈现炎症的后期病变，可见大景逡逑的淤血以及大景的中性粒细胞浸润（图２－１Ｅ）；有大f埛忠逗讼赴仔韵赴笾饕杉行藻义狭Ｏ赴土馨拖赴ㄍ迹玻保疲ｅ义稀觯保咤义贤迹玻蹦膛Ｈ橄僮橹龋湃旧义辖】的膛Ｓ肴榉垦谆疾∧膛５娜橄僮橹衅ǎ矗埃埃劐澹＃梁停挛】的膛Ｈ橄僮橹衅唬茫莆膛Ｈ榉垦谆疾∨Ｈ橄僮橹衅ｅ义希疲椋纾酰颍邋澹玻卞澹龋椋螅簦铮穑幔簦瑁铮欤铮纾椋沐澹牛觯幔欤酰幔簦椋铮铄澹铮驽澹恚幔恚恚幔颍澹裕椋螅螅酰澹箦义希龋椋螅簦铮穑幔簦瑁铮欤铮纾椋沐澹螅澹悖簦椋铮睿箦澹铮驽澹恚幔恚恚幔颍澹簦椋螅螅酰澹箦澹ǎ龋
本文编号：2600525
【图文】：
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