奶牛子宫内膜永生化细胞系的建立

发布时间：2020-03-26 12:47

【摘要】：奶牛子宫内膜作为子宫的壁层具有促进发情周期循环、孕育胎儿、内分泌等作用,在病原微生物侵入子宫时,奶牛子宫内膜不仅作为物理性屏障抵御微生物入侵,还可通过激活子宫局部先天免疫反应恢复自身稳态。奶牛子宫内膜结构复杂、功能交错,导致在体情况下很难对妊娠、子宫内膜炎等生理、病理过程的分子机制作出系统的阐明。虽然以原代细胞为模型进行研究能够最真实的接近在体情况,但是原代细胞仍存在耗时、费力、个体差异大等缺点。因此,建立稳定传代的奶牛子宫内膜细胞体外培养模型,为深入揭示奶牛子宫内膜在发情周期、妊娠、子宫内膜炎过程中的分子机制建立基础,对于奶牛子宫内膜炎症的防控、治疗、提高奶牛的妊娠率具有重要意义。本试验通过将人端粒酶基因(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)转入奶牛子宫内膜基质细胞(endometrial stromal cells,ESCs)和上皮细胞(endometrial epithelium cells,EECs)中,成功筛选构建了永生化奶牛子宫内膜基质细胞系和上皮细胞系,并通过检测角蛋白(Keratin)、波形蛋白(Vimentin)、细胞生长曲线分析、端粒长度分析、核型分析、雌激素和孕酮刺激等方法对构建的细胞系的功能进行了检测,试验结果如下:(1)通过0.25%的胰酶消化法、组织块培养法获得了ESCs和EECs。通过显微镜形态观察和细胞免疫荧光的方法对分离得到的两种细胞纯度进行了形态和细胞类型鉴定,鉴定结果显示:ESCs形态呈梭形,贴壁生长。EECs呈典型的铺路石样、聚团贴壁生长;奶牛ESCs波形蛋白表达为阳性、EECs角蛋白表达为阳性。证明成功获得纯度较高的ESCs和EECs。(2)将pCI-neo-hTERT质粒转ESCs中,经过浓度为400μg/mL的新霉素(G418)筛选14 d后获得ESCs阳性克隆株,扩大培养后命名为TERT-ESCs,TERT-ESCs目前已传至50代。经细胞免疫荧光鉴定,TERT-ESCs中hTERT表达为阳性;通过显微镜观察,TERT-ESCs在传代过程中形态仍为梭形,贴壁生长;CCK 8分析结果显示TERT-ESCs的增殖活力良好;凋亡分析结果表明,和原代ESCs相比TERT-ESCs在传至50代时凋亡率差异不显著;血清依赖性分析结果显示血清促进TERT-ESCs增值呈浓度依赖性;核型分析结果显示转染了hTERT基因的奶牛ESCs在传至50代时,染色体数目保持正常;RT-PCR检测结果显示与原代ESCs相比50代TERT-ESCs正常表达类固醇激素受体;雌激素对TERT-ESCs促增殖作用呈浓度依赖性,低浓度的孕酮对TERT-ESCs具有促增殖作用,高浓度的孕酮具有抑制增殖作用;RT-qPCR分析结果显示,TERT-ESCs在传至30代、50代时端粒长度保持稳定;以上结果表明hTERT基因可以促使TERT-ESCs的永生化。(3)将pCI-neo-hTERT质粒转入EECs,经过浓度为300μg/mL的新霉素(G418)筛选14 d后获得EECs阳性克隆株,扩大培养后命名为TERT-EECs,TERT-EECs目前已传至20代。经细胞免疫荧光鉴定,TERT-EECs中hTERT表达为阳性;传代过程中,TERT-EECs波形蛋白仍呈阳性表达;CCK 8分析结果显示TERT-EECs仍保持良好的增殖活力;通过RT-PCR鉴定分析,TERT-EECs与原代EECs相比可正常表达类固醇激素受体;雌激素对TERT-EECs促增殖作用呈浓度依赖性,低浓度的孕酮对TERT-EECs具有促增殖作用,高浓度的孕酮具有抑制TERT-EECs增殖作用;血清依赖性分析结果显示血清促进TERT-EECs增值呈浓度依赖性;核型分析结果显示转染了hTERT的EECs在传代过程中,染色体数目保持正常。综上所述,本试验将pCI-neo-hTERT质粒转入奶牛ESCs和EECs成功筛选获得了永生化奶牛子宫内膜基质细胞系和上皮细胞系。并通过一系列检测方法鉴定表明两种细胞系可以在体外无限传代且具有正常的生物学功能,证明所得细胞系可以用于后期的试验。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.23

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