基于重组酶聚合酶扩增技术的犬细小病毒快速检测方法的建立

发布时间：2020-03-26 14:42

【摘要】：犬细小病毒病(Canine Parvovirus disease,CPVD)是由犬细小病毒(Canine Parvovirus,CPV)引起的急性、烈性、致死性传染病。该病1978年于美国首次发现并迅速在全球范围内传染流行,临床表现为出血性肠炎型和非化脓性心肌炎型。主要危害2-8月龄幼犬,具有发病急、病程短、传染性强、死亡率高等特点。1982年我国首次报道该病,并迅速在全国范围内流行,是我国主要的犬类传染病之一,严重影响我国养犬业的健康发展。重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Pilymerase Amplification,RPA)是一种新型的核酸等温扩增技术。该技术由重组酶与引物结合形成的复合物在模板上寻找同源序列,定位后引发链交换反应,启动DNA的合成,对模板上的目的片段进行指数扩增,可在25℃-42℃的恒温条件下,10-15分钟即可快速完成目的基因的扩增。扩增产物可与侧流层析试纸条、生物芯片、凝胶电泳等多种方法结合进行检测。该技术敏感性高、特异性强、耗时短、操作简便,是目前可用于现场即时诊断最方便快捷的核酸检测方法。为建立一种快速、简便检测犬细小病毒(CPV)的方法,本研究基于CPV VP2基因的保守序列,设计合成四组RPA引物,筛选得到最佳引物组。通过对反应条件的优化,确定最佳反应条件。建立了犬细小病毒的基础RPA检测方法,并在此基础上初步建立CPV的侧流层析试纸条(LFD)-RPA检测方法。实验结果表明,所建立的RPA方法在38℃恒温反应15 min即可快速、特异性的检测出犬细小病毒。敏感性试验结果显示,以阳性质粒pEASY-CPV-VP2为模板,基础RPA和LFD-RPA的检测限均为1×10~1拷贝/μL,敏感性比普通PCR方法高10倍。特异性试验结果显示,除犬细小病毒(BJ-2b株、BJ-2c株)外,犬瘟热病毒、犬冠状病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒等检测均为阴性。用所建立的基础RPA和LFD-RPA方法对75份CPV粪便疑似阳性临床样品进行检测,阳性检出率为88%,明显高于普通PCR的检出率(80%)和胶体金的检出率(76%)。本研究建立的犬细小病毒RPA检测方法操作简单,反应灵敏,特异性高,适用于CPV的临床快速检测。
【图文】：

图 1 CPV 病毒模式图（Tsao J et al. 1991）Fig. 1 Schematic diagram of CPV结构和编码蛋白组是 条自主复制的单股负链线性 DNA，约含有 532

CPV基因组分子结构
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.292

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本文编号：2601581