氨气诱导仔猪肺纤维化分子机制的初步探究

发布时间：2020-03-26 23:12

【摘要】：氨气是猪舍内常见的有害气体,可通过口鼻吸入进入猪肺,对猪的呼吸道健康造成影响。本课题组前期利用80ppm浓度氨气分别刺激保育仔猪0 d(NC组)、4 d(D4组)、8 d(D8组)和12 d(D12组),发现氨气刺激造成仔猪肺纤维化。本研究基于这一实验结果,借助免疫组化、免疫荧光、Q-PCR和转录组分析等实验方法进一步探索氨气刺激造成仔猪肺纤维化病程变化的分子机制,研究结果可为解析氨气刺激诱导的肺组织损伤提供理论依据。本研究的主要实验结果如下:1.氨气刺激不同时间仔猪肺纤维化程度的统计分析将肺的纤维化程度按照由轻到重划分为F0-F3共四个等级,其中F0无纤维化,F3纤维化最严重。随后对氨气刺激不同时间的仔猪肺组织切片进行纤维化程度的统计与分析,发现D4组主要是F2(44%)和F3(56%),D8和D12组主要是F1(45%,56%)和F2(44%,33%),说明氨气刺激导致仔猪肺的纤维化,并且纤维化程度随着刺激时间的延长呈现出先加重后减缓的现象。2.氨气刺激对仔猪肺泡上皮细胞的损伤分析为了进一步探究氨气刺激导致仔猪肺纤维化的分子机制,本研究首先检测了氨气刺激对仔猪肺泡上皮细胞的影响。通过免疫组化技术,从蛋白水平上分别检测了Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ)和Ⅰ型肺泡上皮细胞(AECⅠ)的标记蛋白SFTPC和AQP5在氨气刺激前后的表达变化,发现AQP5在D4组表达下调,而SFTPC在D4组明显上调,表明氨气刺激引起了肺泡上皮细胞数量的变化,推测AECⅠ可能是肺泡受损的靶细胞,而AECⅡ由于其干细胞特性,在肺泡上皮损伤后通过增殖分化对上皮进行修复。3.上皮-间质转化(EMT)可能参与氨气刺激诱导的仔猪肺纤维化的发生使用免疫荧光双标技术,我们分别检测了AECⅡ和肌成纤维细胞的标记蛋白SFTPC和α-SMA的表达,发现在D4组仔猪肺泡上皮中同时存在上皮细胞和成纤维细胞。进一步借助免疫荧光/免疫组化技术分别对上皮间隙连接蛋白Cnx43、间质细胞标记蛋白vimentin、成纤维细胞标记蛋白S100A4和肌成纤维细胞标记蛋白α-SMA的表达变化,发现Cnx43的表达在D4下调,而其他细胞外基质相关的蛋白表达在D4组上调。以上结果说明氨气刺激后仔猪肺组织出现了EMT现象,且EMT现象在D4组最明显,其变化趋势与纤维化的病程变化相一致,故推测EMT可能参与氨气诱导的仔猪肺纤维化的发生与发展。4.氨气刺激引起仔猪肺纤维化相关基因的表达变化本课题组前期对氨气刺激不同时间的仔猪肺组织进行转录组测序,发现289个差异表达基因(DEGs),其中46个基因在D4组表达量达到峰值,其基因表达变化趋势与肺纤维化病程变化基本一致。因此,我们推测这些基因在氨气诱导的仔猪肺纤维化的发生与发展过程中可能发挥重要作用。本研究通过对以上46个DEGs进行进一步功能注释和分析,发现它们主要与肺泡上皮结构和功能(BPIFA1,BPIFB1,BPIFB2,LBP,LTF,SCGB3A2,DMBT1,ATP6V1C2,CLDN10,SLC5A1,SLC5A8)、细胞外基质生成与降解(MMP7,FGFBP1,CP,OLFM4,AGR2,DPEP1)、转录调控(BHLHA15,RPL18,DPYS,SSPO,SLC28A3)以及炎症(PI3,SAA1,PGLYRP1,CRISP3,C3,KEL,IGLVs,IGLC1,JCHAIN)等相关,其中MMP7,BPIs,IGLVs,SAA1和PI3可能与肺纤维化和EMT密切相关。最后,我们利用Q-PCR技术从mRNA水平上检测了纤维化相关基因MMP7,TGF-β1,COL1A1,CTGF,CDH1,AQP5,S100A4,SFTPC和ACTA2在氨气刺激前后肺组织的表达变化。发现TGF-β1在D4组(p0.05)和D8(p0.01)表达显著上调,COL1A1在D8组(p0.01)表达显著上调,而CTGF(p0.01),CDH1(p0.05),S100A4(p0.05)和ACTA2(p0.01)的表达则在D4组显著下调,AQP5和SFTPC在D8组(p0.01)表达显著。结论:80ppm氨气刺激导致仔猪肺纤维化,并且纤维化程度随着刺激时间的延长呈现出先加重后减缓的现象。上皮-间质转化(EMT)可能参与氨气诱导的仔猪肺纤维化的发生与发展。
【图文】：

肺纤维化,发病机制

图 1-1 肺纤维化的发病机制（King et al 2011）。Fig.1-1 Proposed mechanisms of pulmonary fibrosis (King et al 2011).1.3.3 上皮-间质转化（EMT）与肺纤维化过去对纤维化肺中的 FB 的来源存在争论，，普遍的观点是来源于原始的间质FB 的分化、循环中骨髓源细胞派生 FB 以及上皮细胞的转导分化（Pozharskaya etal 2009）。同样 MF 的来源目前也存在三种理论：第一种理论是原来的纤维母细胞通过表达血小板中的血小板生长因子（PDGF）、上皮细胞中的转化生长因子β1（Transforming growth factor β1, TGF-β1）和肿瘤坏死因子（TNF-α）迁移到受损的位点，随后分化成 MF。第二种理论认为 MF 可能是受循环间质细胞控制的，通过高表达上皮细胞趋化因子将这些细胞吸引到肺脏中去。而第三种假设最近引起了更多的注意，MF 是通过上皮细胞分化成的，上皮细胞之间的细胞连接丢失，上皮细胞表达间质细胞标记蛋白（如α-SMA、纤连蛋白等）转化为 MF，

间质细胞,肺泡上皮细胞,基底膜,上皮细胞

EMT 首先是破坏了上皮细胞之间的连接（如紧密连接、缝隙连接等），细胞间的连接减弱或消失导致基底膜的完整性遭到破坏，从而使得上皮细胞丧失极性。同时伴随着间质细胞基因表达的活化，获得表达上皮和间质标志物的中间表型。这些中间型的细胞进一步转化为间质细胞，表达间质细胞标志蛋白，如 S100 钙结合蛋白 A4（S100 calcium binding protein A4, S100A4）、波形蛋白（vimentin）和α-SMA（Samy et al 2014）。目前对 EMT 过程还存在争议，EMT 过程是一个动态过程，要想准确的鉴定 EMT 过程需要在体内实时观察到上皮细胞转化为间质细胞，然后穿过基底膜进入间质的全过程，但是目前的技术还无法达到这个目标。因此，肺泡上皮细胞黏附因子 E-cadherin、肺泡上皮细胞间隙连接蛋白 43（connexin43，Cnx43）、肌成纤维细胞标记蛋白α-SMA 和间质细胞标记蛋白vimentin 等多种 EMT 标志蛋白的鉴定成为了目前 EMT 检测普遍使用的方法和手段（Pain et al 2014, 易建华 2012）。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.28

【参考文献】