PTD-FNK蛋白抑制TM3凋亡的研究

发布时间：2020-03-27 23:20

【摘要】：PTD-FNK蛋白是一种人造蛋白,是将FNK蛋白与蛋白转导域(PTD)融合而形成的人工抗细胞死亡蛋白,它进入细胞的速度极快,已经被证实对由各种原因引起的细胞凋亡具有一定的保护作用。目前为止,虽然PTD-FNK蛋白的功能研究非常的广泛,但是未见将其运用于保护小鼠睾丸间质细胞(TM3)异常凋亡的研究。本试验以TM3为研究对象,检测不同浓度的PTD-FNK蛋白对二甲磺基乙烷(EDS)诱导的TM3不正常凋亡的保护效果,为进一步认识PTD-FNK蛋白的生理功能提供试验依据,加快其在雄性动物生殖调控方面的临床应用进程。具体研究内容如下:首先,将TM3体外培养并用3β-HSD细胞免疫荧光染色对TM3进行纯度鉴定;其次,挑取生长状态比较好的TM3,用胰蛋白酶消化并传代后,当TM3长到大概有80%左右的融合度时,以不同的PTD-FNK蛋白(100、50、5、0.5、0.05 nmol/L)提前孵育TM3 0.5 h,然后用凋亡诱导剂EDS(750μg/mL)对TM3诱导24 h,用增强型CCK-8法检测各组TM3的活力,用Hoechst33342和PI双染法在荧光显微镜下检测PTD-FNK蛋白对TM3凋亡、坏死的影响;最后,用酶标仪检测PTD-FNK蛋白对TM3内Caspase-3、Caspase-9活性的影响。结果显示:(1)体外培养的细胞在37℃下的细胞培养箱(含有5%的C02)里,长势乐观,形态较好,在12～36 h时是其对数增长期。经3β-HSD染色鉴定后,在荧光显微镜下显示有大量的绿色细胞颗粒,说明此细胞是TM3且纯度比较高。(2)与EDS阴性对照组相比,PTD-FNK蛋白试验组的TM3活力均升高。其中0.5 nmol/LPTD-FNK蛋白极显著增加TM3的活力(P0.01),5、0.05nmol/L的PTD-FNK蛋白显著增强 TM3 的活力(P0.05),50nmol/L、100nmol/L 的 PTD-FNK 蛋白组TM3活力与对照组相比差异不显著(P0.05)。(3)TM3经Hoechst33342、PI双染检测,显示各组细胞坏死不明显,而EDS阴性对照组有大量的强蓝色荧光以及红色的荧光,TM3凋亡与坏死最多;与EDS的阴性对照组相比,0.5nmol/L的PTD-FNK蛋白组显著降低TM3的凋亡(P0.01),50、5、0.05 nmol/L 的 PTD-FNK 蛋白可显著降低 TM3 的凋亡(P0.05);100nmol/L的PTD-FNK蛋白组与对照组相比则差异不显著(P0.05)。未添加PTD-FNK蛋白和EDS的空白对照组TM3凋亡得最少。(4)与阴性对照组相比,0.05、5nmol/L的PTD-FNK蛋白能显著降低EDS(750μg/mL)作用下 TM3Caspase-3 的活性(P0.05),0.5nmol/L 的 PTD-FNK 蛋白能极显著降低EDS(750μg/mL)诱导的TM3Caspase-3的活性(P0.01)。与对照组相比,各个试验组Caspase-9的活性没有显著变化,表明PTD-FNK蛋白抑制TM3凋亡的机制可能与Caspase-9活性抑制无关。综上所述,PTD-FNK蛋白可能通过降低EDS诱导凋亡的体外培养TM3 Caspase-3的活性,降低TM3的凋亡量,最终提高TM3的活力。
【图文】：

PTD-FNK蛋白抑制TM3凋亡的研究

图２－１邋ＴＭ３邋３Ｐ－ＨＳＤ染色鉴定逡逑

曲线,蛋白,标尺,规格

０邋Ｎ邋Ｃ邋０．０５邋０．５逦５逦５０逦１００逡逑ＰＴＤ－ＦＮＫ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ邋（邋ｎｍｏｌ／Ｌ）逡逑图２－２邋ＰＴＤ－ＦＮＫ蛋白对ＥＤＳ诱导凋亡的ＴＭ３活力的影响逡逑Ｆｉｇ．２－２邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＰＴＤ－ＦＮＫ邋Ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋Ｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆ邋ＴＭ３邋Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ邋－邋Ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｂｙ邋ＥＤＳ．逡逑（Ａ）增强型ＣＣＫ－８检测ＴＭ３的最佳孵育时间．（Ｂ）增强型ＣＣＫ－８检测ＴＭ３的最佳密度曲线．（Ｃ）逡逑增强型ＣＣＫ－８检测ＰＴＤ－ＦＮＫ蛋白对ＥＤＳ诱导凋亡的ＴＭ３活力的影响．（注：＊号表示差异显著，逡逑Ｐ＜０．０５；邋＊＊表示差异极显著，Ｐ＜０．０１）．逡逑（Ａ）邋Ｅｎｈａｎｃｅｄ邋ＣＣＫ－８邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＴＭ３邋ｆｏｒ邋ｏｐｔｉｍａｌ邋ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ邋ｔｉｍｅ．邋（Ｂ）邋Ｅｎｈａｎｃｅｄ邋ＣＣＫ－８邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ逡逑ｔｈｅ邋ｏｐｔｉｍａｌ邋ｃｅｌｌ邋ｄｅｎｓｉｔｙ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆ邋ＴＭ３．邋（Ｃ）邋ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＰＴＤ－ＦＮＫ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｏｎ邋ＥＤＳ－ｉｎｄｕｃｅｄ邋ａｐｏｐｔｏｓｉｓ邋ｏｆ逡逑ＴＭ３邋ｂａｓｅｄ邋ｏｎ邋Ｅｎｈａｎｃｅｄ邋ＣＣＫ－８邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋（Ｎｏｔｅ：＊，邋Ｐ＜０．０５；邋＊＊，邋＾＜０．０１）．逡逑２．４邋ＴＭ３的凋亡与坏死逡逑经Ｉｍａｇｅ邋Ｊ统计学分析，结果如下：ＥＤＳ阴性对照组（图Ｂｌ、Ｂ２），有大量的强逡逑蓝色荧光以及较明显的红色荧光，其荧光值最大，，表明此组ＴＭ３凋亡与坏死最多；与逡逑添加了邋ＥＤＳ的阴性对照组相比（图ＦＩ、Ｆ２）
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S814

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