牦牛KDM1A的表达谱分析及其对卵母细胞减数分裂成熟的影响

发布时间：2020-03-27 23:04

【摘要】：牦牛(Bos grunniens)主要生活在中国青藏高原地区,是牧区人民的生产资料之一,但是其季节性发情和繁殖效率低的缺陷严重影响了牧区的经济收入。近年来,为改善这一现状,关于牦牛生殖生理方面开展了大量的研究,发现卵母细胞成熟质量直接影响受精后胚胎移植、发育、妊娠率以及犊牛的成活率。已有相关报道表明,组蛋白去甲基化酶调控了卵母细胞的成熟过程,且KDM1A在卵母细胞成熟发育过程的表达水平呈动态变化。但是,KDM1A是如何调控牦牛卵母细胞成熟的尚未见报道。因此本研究通过克隆获得牦牛KDM1A基因序列,并分析其生物信息学和组织表达谱,利用KDM1A特异性抑制剂GSK-KDM1A,初步探索KDM1A在牦牛卵母细胞减数分裂过程中的功能作用,结果如下:1.克隆得到牦牛KDM1A基因2 401 bp的cDNA序列。同源性结果表明,该基因在进化过程中较为保守。对其组织表达谱分析发现,其在牦牛体内广谱表达,特别是卵巢、睾丸中表达量较高,推测其在牦牛繁殖生理活动中起一定作用;2.免疫组化结果显示,KDM1A在牦牛卵巢颗粒细胞、卵母细胞中均有表达;RT-qPCR结果显示,KDM1A在卵母细胞中的表达呈动态分布,其中MⅠ期表达水平极显著低于MⅡ和GV期(P0.01),GV期KDM1A的表达水平和MⅡ期该基因的表达差异不显著(P0.05),表明KDM1A参与了牦牛卵母细胞减数分裂成熟过程;3.在卵母细胞成熟液中添加不同浓度GSK-KDM1A,探究其对卵丘细胞扩展程度,卵母细胞成熟率及受精后胚胎发育潜能的影响。结果显示,牦牛COCs在添加了不同浓度抑制剂培养中培养24 h后,160 nM和320 nM GSK-KDM1A处理组的卵丘细胞的扩散值、卵母细胞成熟率以及卵裂率均显著低于对照组(P0.05);各组囊胚的形成率无显著差异(P0.05);随后检测不同浓度GSK-KDM1A对胚胎干性转录因子表达的影响,结果显示,抑制KDM1A表达将上调OCT4、SOX2的表达(P0.05),而NANOG的表达无显著差异(P0.05),表明牦牛卵母细胞减数分裂成熟受KDM1A调控,且下调该基因的表达会显著降低卵母细胞成熟及胚胎的发育潜力;综上,本试验成功获得了牦牛KDM1A的基因序列,其在进化过程中高度保守;在牦牛体内广谱表达,尤其是在卵巢和睾丸器官中,表明其与牦牛的生殖生理密切相关。通过添加其特异性抑制剂,显著影响牦牛卵母细胞的减数分裂成熟及胚胎的发育潜力,揭示KDM1A参与了牦牛卵母细胞的发育并起重要作用,但其具体作用机制有待进一步研究。因此,本试验为进一步研究KDM1A功能及其在牦牛生殖生理过程中的作用奠定基础。
【图文】：

催化反应机理

图 1.2 KDM1A 的催化反应机理（阮建斌等, 2008）Fig 1.2 The catalytic mechanism of KDM1A9.2.2 KDM1A 相关研究进展KDM1A 在哺乳动物组织中是普遍表达，，并且可通过抑制或激活相关基因转录来调控 DNA 损伤、还原转录子的活性以及纺锤体和染色体的缺失，进而在多种生体的生殖细胞系中发挥重要作用(翟曜耀等, 2012; Nottke et al., 2009; Wang et a2007; Kim et al., 2015; Wang et al., 2016; Lim et al., 2010)。此外，还有研究发现该基同样参与了癌症发生转移、胚胎发育的调节、机体造血的调控以及性激素受体介导因的转录调控等过程(翟曜耀等, 2012; Yeh et al., 2000; Huang et al., 2007; Tsai et a2008; Shao et al., 2008; Hu et al., 2009)，由此可知，KDM1A 基因在哺乳动物生殖发调控、造血系统、多能干细胞的调控及内分泌等相关生物学活动的调节中均起重要用。9.2.2.1 与癌症相关的研究

牦牛,基因,PCR扩增,原鸡

图 2.1 牦牛 KDM1A 基因 PCR 扩增结果Fig 2.1 Result for PCR amplification of yak KDM1Aer；1.第 1 段 PCR 产物；2.第 2 段 PCR 产物；3 第 3 段 Per; 1. First PCR product of yak KDM1A; 2. Second PCR prodof yak KDM1A1A 基因同源性比较及进化树构建所得的牦牛 KDM1A 基因与黄牛(XM_0052033.2）、绵羊（XM_012152442.2）、山羊（XM_99567.1 ）、骆驼（ XM_010979844.1 ）、人 (KJ_.1 ）、猫 (XM_019836867.1) 、马 (XM_014737.1）、兔（XM_008265704.2）、原鸡（XM_015297594.4）进行比对，分别是 99.6%、99.7%、97.6%、93.0%、92.9%、93.0%、89.4%、89.5%、81.5%、77
【学位授予单位】：西南民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S823.85

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