中性粒细胞胞外诱捕网对奶牛乳腺组织的免疫损伤作用及机制

发布时间：2020-03-28 22:41

【摘要】：奶牛乳腺炎是造成奶牛养殖业重大经济损失的主要疾病之一,根据症状表现可分为临床和隐性乳腺炎,无论哪种类型乳腺炎均以泌乳量大幅度下降为特征,主要是由于承担泌乳功能的乳腺上皮细胞在发病过程中遭受损伤所致,损伤的原因,一方面可能源自病原;另一方面,乳腺腺泡导管系统内存在数量巨大的中性粒细胞等天然免疫细胞,这些免疫细胞可通过释放胞外诱捕网、吞噬和降解等方式杀灭进入乳腺导管系统的病原,在此过程中也可能会对乳腺上皮细胞造成损伤。胞外诱捕网作为一种近年来新发现的天然免疫应答机制,在发挥抗病原作用的同时,可被迅速降解,若胞外诱捕网形成过多或降解不及时,则可能引起组织或器官的免疫性损伤。奶牛乳腺炎发生时,出现在乳腺导管系统残存乳汁当中的中性粒细胞是否会释放胞外诱捕网杀灭病原?乳腺上皮细胞损伤导致的泌乳能力下降是否也与胞外诱捕网有关?这些问题的解答对于阐述奶牛乳腺炎详细的发病机制具有重要意义。本论文通过建立胞外诱捕网定性与定量分析方法,证实乳腺腺泡内是否存在胞外诱捕网,进而分析对乳腺组织的损伤情况,并初步揭示胞外诱捕网对乳腺上皮细胞的损伤机制。首先,建立胞外诱捕网的定性与定量分析方法。利用不同类型的刺激物刺激天然免疫细胞,建立了扫描电镜和激光共聚焦为基础的胞外诱捕网形态学定性分析方法;利用染料Sytox Green和Pico Green与荧光酶标仪建立了不同类型刺激物刺激胞外诱捕网形成的定量分析方法,为后续实验的开展提供了方法学的支持。其次,证实乳腺炎小鼠乳腺导管系统内存在中性粒细胞胞外诱捕网,并且胞外诱捕网的释放与乳腺上皮损伤密切相关。分别利用脂多糖和金黄色葡萄球菌建立临床和隐性乳腺炎小鼠模型,制作乳腺组织石蜡切片,结果发现两种类型乳腺炎小鼠,乳腺组织均呈现水肿、腺泡结构完整性破坏及大量炎性细胞浸润;ELISA检测乳腺组织炎性细胞因子水平变化,结果显示TNF-α、IL-1β和IL-6的水平显著升高;扫描电镜和激光共聚焦观察发现,乳腺炎小鼠模型组的乳腺腺泡导管内存在典型的胞外诱捕网结构,该结构主要由DNA骨架和组蛋白、弹性蛋白及髓过氧化物酶组成;利用能够降解胞外诱捕网的DNase I腹腔注射预处理小鼠,临床和隐性乳腺炎小鼠乳腺组织损伤程度减轻,细胞因子水平降低;利用胞外诱捕网抑制剂Cl-amidine腹腔注射预处理小鼠,也可以改善金葡菌和脂多糖引起的乳腺组织损伤。以上结果证实,乳腺导管系统内胞外诱捕网的水平与乳腺组织损伤情况密切相关。再次,体外研究胞外诱捕网对小鼠乳腺上皮细胞的损伤机制。利用PMA刺激小鼠中性粒细胞后收集上清,提取胞外诱捕网,将胞外诱捕网和降解成分分别加入小鼠乳腺上皮细胞培养液孵育,结果细胞培养上清中乳酸脱氢酶水平均显著升高,提示胞外诱捕网及其降解成分都对小鼠乳腺上皮细胞呈现毒性作用;进一步分析发现组蛋白单独刺激小鼠乳腺上皮细胞,培养上清中的乳酸脱氢酶水平也显著升高,提示胞外诱捕网的主要成分组蛋白可损伤小鼠乳腺上皮细胞;小鼠乳导管注入组蛋白观察乳腺组织病理学变化,发现组蛋白可引起小鼠乳腺组织炎性细胞浸润、腺泡结构完整性破坏、细胞因子IL-1β和IL-6的水平显著升高,以上实验在细胞和组织水平上均证实组蛋白对乳腺上皮细胞具有损伤作用;为进一步分析组蛋白损伤小鼠乳腺上皮的作用机制,在培养上清中加入不同浓度的组蛋白处理小鼠乳腺上皮细胞,流式细胞术和蛋白免疫印迹分析证实组蛋白可诱导小鼠乳腺上皮细胞发生凋亡、坏死和焦亡。最后,在本体动物奶牛上进一步证实胞外诱捕网损伤奶牛乳腺上皮细胞的作用机制。植块法和差速消化法分离培养奶牛乳腺上皮细胞,经角蛋白-18和免疫荧光鉴定,证实获得了原代奶牛乳腺上皮细胞;PMA刺激奶牛中性粒细胞,收集上清提取胞外诱捕网,然后将胞外诱捕网和降解成分分别加入奶牛乳腺上皮细胞培养液孵育,结果细胞培养上清中乳酸脱氢酶水平均显著升高,提示胞外诱捕网及其降解成分都对奶牛乳腺上皮细胞呈现毒性作用;培养上清中加入不同浓度的组蛋白处理奶牛乳腺上皮细胞,分析发现奶牛乳腺上皮细胞生长减慢、皱缩变圆,上清中乳酸脱氢酶水平显著升高,提示组蛋白对奶牛乳腺上皮细胞具有毒性作用;流式细胞术分析结果显示,奶牛乳腺上皮细胞出现细胞凋亡(Annexin V+/PI-)、坏死(Annexin V+/PI+)和焦亡(Annexin V-/PI+)等死亡方式;蛋白免疫印迹进一步分析,发现组蛋白激活caspase-1、NLRP3和caspase-3,从而诱导奶牛乳腺上皮细胞发生凋亡、坏死和焦亡。通过以上研究,本论文证实了乳腺导管系统内存在中性粒细胞胞外诱捕网,胞外诱捕网的主要组成成分组蛋白可通过激活caspase-1、NLRP3和caspase-3,诱导乳腺上皮细胞发生焦亡、凋亡和坏死,从而损伤乳腺组织。以上研究补充了有关奶牛乳腺炎疾病发生与发展过程中乳腺上皮损伤导致产奶量下降的详细机制,为奶牛乳腺炎免疫学防治研究提供了新的研究视角,同时也为兽医临床实践中有效防控乳腺炎的发生提供理论指导和实验依据。
【图文】：

诱捕网,扫描电镜法,中性粒细胞,巨噬细胞

图 1.1 扫描电镜法观察中性粒细胞和巨噬细胞的胞外诱捕网。（A）中性粒细胞胞外网观察（B）巨噬细胞胞外诱捕网结构观察。Figure 1.1 SEM analysis of NETs and METs formation. (A). Observation of NETs-lietwork structures. (B) Observation of bovine macrophages ETs-like network structures.

免疫荧光法,绿色,情况,合并图

1.2 免疫荧光法检测 NETs 的 DNA 与 Histone、NE 和 MPO 共定位情况(90me(绿色)。（D）MPO(绿色)。（G）NE(绿色)。（B）、（E）和（H）代表 DNA(红色（I）分别分别代表 Histone、NE 和 MPO 与 DNA 合并图像。gure 1.2 Immunofluoresce analysis of DNA decorated with Histone, NE andtructures (90min). DNA decorated with of Histone, NE and MPO within NETs wer
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.23

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