CMAH、β4GalNT2基因敲除猪的制备及急性免疫反应检测

发布时间：2020-03-30 01:42

【摘要】：异种器官移植是解决供体器官短缺的有效途径,猪(Sus scrofa)由于器官大小、生理解剖结构与人相近、繁殖率高、饲养成本低等优势,被认为是理想的异种器官移植供体。猪器官移植到人体内将会引起超急性免疫排斥反应(hyperacute rejection,HAR),敲除猪的α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)可以避免HAR。然而猪的细胞表面仍存在多种非半乳糖抗原,它们在猪内皮细胞及多种器官中均有所表达,能够在异种器官移植中引起诸如抗体沉积、补体激活等抗体介导的急性排斥反应,其中包括N-羟乙酰神经氨酸(N-glycolylneuraminic acid,Neu5Gc)和猪的Sd~a血型抗原。N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)是由单磷酸胞嘧啶-N-乙酰神经氨酸羟化酶(cytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid hydroxylase,CMAH)催化生成的一种唾液酸。猪的Sd~a血型抗原是由猪的一种糖基转移酶即β1,4N-乙酸氨基半乳糖转移酶(β-1,4-N-acetyl-galactosaminyltransferase 2,β4GalNT2)催化合成的,人类和大多数非灵长类动物都会产生与Sd~a血型抗原结合的抗体。本研究在α-1,3-半乳糖基转移酶基因敲除(GGTA1knockout,GTKO)猪的基础上利用CRISPR/Cas9和体细胞核移植技术制备CMAH基因敲除(CMAH~(-/-))巴马小型猪和β4GalNT2基因敲除(β4GalNT2~(-/-))巴马小型猪,并评估了CMAH~(-/-)巴马小型猪的健康及繁育状况。1.以GTKO猪为基础,针对猪CMAH基因设计sgRNA并构建sgRNA/Cas9表达载体并进行活性验证,筛选敲除效率较高的CMAH-g1,采用电转染的方式将载体转入巴马猪耳成纤维细胞BMEF(Bama minipigs Ear Fibroblast),鉴定为阳性的细胞作为核供体,利用体细胞核移植技术(Somatic Cell Nuclear Transfer Technique,SCNT)制备CMAH~(-/-)猪。提取仔猪基因组进行PCR,鉴定仔猪突变类型;用Anti-Neu5Gc抗体进行免疫荧光检测确定仔猪器官Neu5Gc表达情况。采集CMAH~(-/-)巴马猪血液检测其生理指标;CMAH~(-/-)巴马公猪性成熟后配种,以母猪的产仔数评价CMAH~(-/-)公猪的繁育能力。结果成功获得了-2bp/-2bp和-1bp/-1bp共2种纯合敲除类型的CMAH~(-/-)巴马猪。免疫荧光检测结果显示在CMAH~(-/-)猪的胰腺、主动脉表面未检到Neu5Gc表达。与野生猪(WT)相比,CMAH~(-/-)猪血常规和血生化指标正常,CMAH~(-/-)公猪的生产力正常。2.以GTKO猪为基础,针对猪β4GalNT2基因第三外显子设计sgRNA导向序列引物,构建sgRNA/Cas9表达载体并进行活性验证,敲除效率高的载体电转染BMEF。采用PCR、TA克隆及测序的方法鉴定单细胞克隆的突变类型,选择阳性克隆点作为核供体,利用体细胞核移植技术制备β4GalNT2~(-/-)猪。分离仔猪外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)与异硫氰酸荧光素标记的双花扁豆凝集素(Fluorescein isothiocyanate conjugated Dolichos biflorus agglutinin,FITC-DBA)共孵育,检测仔猪β4GalNT2的表达。本次使用敲除效率最高的bGal-g5制备敲除猪。经过鉴定,成功获得了基因型为+1bp/-3bp/-17bp的β4GalNT2基因敲除猪。细胞及仔猪鉴定结果均显示其有三种敲除类型,说明猪β4GalNT2基因是多拷贝基因。仔猪PBMC与FITC-DBA共孵育后没有绿色荧光,说明仔猪β4GalNT2基因已失活。3.采集WT巴马猪、GGTA1基因敲除(GTKO)巴马猪、CMAH~(-/-)巴马猪、β4GalNT2~(-/-)巴马猪的血液并分离其PBMC,与灭活的混合AB型人血清及猴血清共孵育,通过流式检测猪PBMC与人、猴血清中抗体的结合情况。结果显示,敲除GGTA1基因能够有效地降低与猪PBMC结合的抗体量,在敲除GGTA1基因的基础上敲除猪的CMAH基因或β4GalNT2基因,都能够在原基础上继续降低抗体的结合量。本研究利用CRISPR/Cas9技术和体细胞核移植技术成功制备了GGTA1/CMAH基因敲除猪和GGTA1/β4GalNT2基因敲除猪,GGTA1/CMAH基因敲除猪的健康状况和繁育能力正常。抗原抗体反应结果表明,敲除猪的CMAH基因和β4GalNT2基因能够降低人、猴血清中的抗体结合含量,本次获得的两种基因敲除猪可为进一步降低异种器官移植急性排斥反应提供基础研究材料。
【图文】：

异种移植,治疗方法,超急性排斥反应,免疫排斥

图 1-1 异种移植是一种潜在的治疗方法(Ekser et al., 2012)Fig.1-1 Disorders for which xenotransplantation is a potential therapy(Ekser et al., 2012)1.1.2 免疫排斥种类1.1.3.1 超急性排斥反应(Hyperacute rejection，HAR)经过科学家们多年研究的发现，将异源的器官移植到人或者非灵长动物体内，4

活时间,器官,细胞,异种移植

现阶段临床使用的治疗患者糖尿病的胰岛素均来自猪，说明使用猪胰岛对进行治疗是安全有效的。Windt 等人在 2009 年将表达 hCD46 的猪胰岛细胞移植到糖尿病的食蟹猴体内并在移植后使用免疫抑制剂，在不注射胰岛素的情况下，移植作用时间超过了一年(Windt et al., 2009)。将经藻酸盐胶囊化的猪胰岛细胞移植到糖非灵长类动物皮下后，胰岛细胞可维持功能近 6 个月(Dufrane et al., 2010)。.1.5.2 心脏移植Kuwaki 和 Shimizu 等人分别在 2005 年和 2008 年发表了文章，文章表明，两个研队将敲除了 GGTA1 基因的猪心脏采用异位移植的方式植入狒狒的体内，最长可维能 6 个月的时间(Kuwakietal.,2005；Shimizuetal.,2008)。此后，，在 2012 年，Mohiud在团队将敲除 GGTA1 同时转入人 CD46 基因的猪心脏进行移植，移植后器官受体时间长达 236 天(Mohiuddin et al., 2012)。除此之外，异种移植在肝脏、肾脏、小肠、肺移植等方面均已经进行了大量工取得了一定进展(图 1-2)。尽管在异种移植领域需要克服的困难还有很多，但随着异官在受体体内维持功能的时间不断延长和诸多科研人员在异种移植研究中的通力，相信这一难题很快会被解决。异种器官移植解决人类器官短缺的难题指日可待。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S828

【参考文献】