PouV基因标记鸡体细胞诱导重编程的研究

发布时间：2020-03-30 05:27

【摘要】：细胞重编程技术可以将已经分化的体细胞重新诱导成多能性干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells,iPSC),重新赋予分化任何细胞的潜力,这对濒危鸟类或珍稀家禽种子资源保护与利用具有重要的价值。本研究以鸡为模型,构建一个标记鸡内源PouV基因的荧光报告系统,以便追踪体细胞重编程过程。从而探索体细胞重编程为iPSC的条件和机制。首先,本研究利用基因编辑技术CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9),将红色荧光mCherry通过同源臂介导的末端连接(Homology-Mediated End Joining,HMEJ)方式定点插入鸡内源PouV基因最后一个外显子的终止密码子处,从而示踪鸡内源PouV基因表达情况。结果显示:成功构建了鸡内源性PouV启动子驱动mCherry基因的pPouV-mCherry表达载体,并将该载体转染鸡体细胞,成功筛选出pPouV-mCherry鸡体细胞系。为鸡体细胞诱导重编程建立了一个标记内源PouV基因的荧光报告示踪体系。而后,我们利用PiggyBac转座子作为载体将鸡源3个多能转录因子Nanog、PouV、Lin28(NPL)转入pPouV-mCherry鸡体细胞中进行诱导,来探索鸡体细胞诱导iPSC的条件和机理。试验成功构建了携有鸡源的3个多能基因Nanog、PouV和Lin28(NPL)的过表达载体PB-NPL-eGFP,并将该过表达载体转染pPouV-mCherry鸡体细胞中进行诱导。结果显示:标记pPouV-mCherry鸡胚成纤维细胞和鸡胚心肌细胞在诱导过程中细胞都出现死亡现象,而pPouV-mCherry DF-1在诱导第7天时,细胞开始变红;诱导第30天,红色克隆逐渐变大,与饲养层分界明显具有一定的立体感,细胞形态类似于iPSC。经手工传代后,诱导第35天,红色克隆细胞开始凋亡,红光也逐渐消失。将诱导第30天红色克隆进行碱性磷酸酶染色和多能基因表达分析鉴定,结果显示:红色细胞克隆表现碱性磷酸酶阳性,5个多能转录因子Nanog、PouV、Lin28、c-Myc和Klf4与体细胞相比都显著上调,家禽干细胞相关的多能基因TBX3、TFCP2L1、ENS-1和c-Kit与体细胞相比也都显著上调。这些结果表明了内源PouV标记的荧光报告载体可以示踪体细胞重编程,诱导获得的红色细胞克隆具有多能细胞特性。综上所述,本试验建立了鸡内源PouV标记的体细胞诱导重编程的追踪体系,并利用该追踪体系,成功将pPouV-mCherry DF-1诱导成具有多能特性的细胞克隆。本研究为进一步开展家禽体细胞重编程研究揭示家禽体细胞重编程的条件和机理奠定基础。
【图文】：

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论文逦ＰｏｕＶ基因标ｉ己鸡体细胞诱导重编程的研究进展逡逑程对于生物体内来说，是一个非常重要而且复杂的过程。细胞从分化，，变成机体内各组织器官。细胞的特性也从刚开始的全能性细胞，再分化变成前体细胞，最终分化为成体细胞，每一阶段细态。上世纪５０年代以来，由英国著名胚胎学家Ｃ．Ｈ．Ｗａｄｄｉｎｇｔｏｎｇｔｏｎ景观模型来解释细胞发育过程，他把细胞发育看作小球从一至下方的过程，小球位置越高细胞发育能力越强（图１－１）。Ｗａｄｄｉｎｇｔ”模型反映了细胞发育总是从潜力高的细胞类型分化成潜力低的■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■

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广西大学硕士学位论文逦ＰｏｕＶ基因标记鸡体细胞诱导重编程的研究逡逑ＤＳＢ），在自然界生命体中，一般细胞机体会有两种ＤＮＡ修复方法：第一种是同源同逡逑组（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ邋Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，邋ＨＲ）的修复方式，第二种是非同源末端连接（Ｎｏｎ－逡逑ＨｏｍｏｌｏｇｏｕｓＥｎｄ】ｏｉｎｉｎｇ，ＮＨＥＪ）修复方式（图１－２）。通过这两种修复方式使得ＤＮＡ在逡逑断裂后能自然的进行修复连接［５６］。逡逑
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S831

【参考文献】