奶牛乳腺炎中金黄色葡萄球菌转录因子SarS、SarV和VraR的功能研究

发布时间：2020-03-30 18:37

【摘要】：奶牛健康养殖是中国畜牧业可持续发展的前提。传统奶牛养殖业中,不规范的饲养管理方式使养殖环境不断恶化,导致奶牛乳腺炎发生率不断升高。奶牛乳腺炎是影响奶牛健康养殖的主要疾病,不仅给奶牛养殖业造成巨大的经济损失,还威胁到食品安全和人类健康。为了治疗奶牛乳腺炎,多种抗生素被开发,并成为目前治疗奶牛乳腺炎的主要手段。但是,由于在实际畜牧生产过程中大量且不合理使用抗生素,导致对抗生素具有多重耐药性的菌株不断出现,使奶牛乳腺炎治愈率越来越低。因此,研究奶牛健康养殖,需要研究引起奶牛乳腺炎病原菌耐药性的产生机理。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起奶牛乳腺炎的主要病原菌之一,其致病性强,且具有极强的环境适应能力和抗生素耐受性。本课题组前期试验发现,通过对金黄色葡萄球菌野生型菌株BA01611和苯唑西林处理BA01611的转录组测序数据分析,发现3个表达量差异显著的转录因子SarS、SarV和VraR。本研究首先通过qRT-PCR验证与转录组测序结果的一致性;然后,利用基因敲除的方法探究SarS、SarV和VraR对金黄色葡萄球菌表型的影响;最后,本论文还试图找到vraR调控的下游基因。主要结果如下:1.qRT-PCR与测序结果的一致性检验。分析qRT-PCR的数据发现,与野生菌相比,经苯唑西林处理后,sarS、sarV和vraR的表达量分别为野生菌株表达量的0.56、0.79、15.45倍,与转录组结果一致。2.目的基因敲除菌和过表达菌株的构建。本试验利用同源重组的方法,利用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌穿梭载体pKZ2,成功构建了sarS、sarV和vraR基因敲除菌BA01611-ΔsarS、BA01611-ΔsarV和BA01611-ΔvraR;以质粒pSE1为基本骨架,成功构建vraR的过表达菌株。3.SarS与金黄色葡萄球菌对苯唑西林、万古霉素、替考拉宁的抗性均无关,而SarV、VraR能够提高金黄色葡萄球菌对苯唑西林和替考拉宁的抗性。SarS抑制金黄色葡萄球菌的生物膜形成能力,而SarV、VraR与金黄色葡萄球菌的生物膜形成能力无关。Sar S、SarV和VraR都能减弱金黄色葡萄球菌的溶血能力,对金葡菌凝固血浆的作用均不明显。4.探究了vraR调控的下游基因。通过对实时定量PCR数据的分析发现,甲氧西林抗性基因mecA在BA01611(WT)、BA01611-ΔvraR和BA01611-ΔvraR-complement三株菌中的表达量无显著差异,表明vraR并不参与mecA的表达调控。进一步分析qRT-PCR的数据发现,8个基因在mRNA水平的表达量受vraR的调控,这8个基因为:vraX、vraC、vraS、msrR、murA2、mgt、SAOUHSC_01761和SAOUHSC_02101。综上所述,本研究利用基因敲除手段,成功构建了sarS、sarV、vraR基因敲除菌,并在此基础上探究了SarS、SarV和VraR对金黄色葡萄球菌表型的影响。此外,还通过qRT-PCR的方法找到8个vraR调控的下游基因,并对这些基因的功能做出分析,为探究金黄色葡萄球菌的耐药机理提供理论基础。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.23

【参考文献】