氟化钠诱导小鼠肾脏损伤的作用机理研究

发布时间：2020-03-30 15:32

【摘要】：氟在土壤、空气、岩石和水中广泛存在,是机体所必需的微量元素之一。同时,氟也常被应用到医药、口腔护理产品以及诸如化肥、钢铁、铝、陶瓷等工农业生产实践中。适量的摄入氟有益于牙釉质的形成和骨骼的矿化,而过量的摄入氟则会造成机体骨相和非骨相组织的严重损害。肾脏是机体内氟的主要蓄积和排泄器官,对氟的毒性非常敏感。研究显示,过量的摄入氟可诱导肾脏发生病理组织学变化、细胞凋亡和细胞周期阻滞等一系列的损伤。然而,氟诱导肾脏损伤的分子作用机理目前还尚不清楚。因此,本研究以ICR小鼠为研究对象,运用实验病理学、流式细胞术、qRT-PCR、Western blotting、ELISA和TUNEL等研究方法,以肾脏结构、功能、抗氧化能力、细胞周期、凋亡、自噬、炎症反应和PI3K-Akt信号通路中相关因子的蛋白及基因表达的观测为目标,从组织、细胞和分子水平探讨氟化钠(NaF)对小鼠肾脏的毒性作用及其可能的分子作用机理,以填补氟在这些方面的研究空白,并为进一步研究氟对肾脏的毒性效应提供理论依据及数据参考。研究内容和研究结果如下:1.NaF对小鼠肾脏结构、功能和抗氧化能力的影响本试验选用240只(雌雄各半)4周龄健康ICR小鼠,随机均分为4个组,适应性饲养一周,然后经灌胃途径给予小鼠不同剂量的NaF(0、12、24和48 mg/kg),灌胃量为1mL/100g,试验期为42天。试验期间,每天对小鼠进行临床观察。试验第21和42天对小鼠肾脏进行病理学观察。结果表明,NaF的剂量达到12 mg/kg及以上时可引起肾脏出现不同程度的体积缩小、脏器指数降低、肾小管上皮细胞变性或/和坏死、炎性细胞浸润、肾小管透明管型形成以及肾小球肿大,肾脏组织结构受损。上述病变呈现明显的时间和剂量依赖性。试验第21和42天,运用生物化学法检测小鼠肾脏功能指标。结果表明,NaF的剂量达到12 mg/kg及以上时可提高血清Cr、UA、BUN的含量以及肾脏LDH的活性和尿液NAG的活性,降低肾脏Na+/K+-ATPase和ACP活性,肾脏功能受损。试验第21和42天,运用生物化学和qRT-PCR法检测小鼠肾脏氧化损伤指标、非酶性和酶性抗氧化指标。结果表明,NaF的剂量达到12 mg/kg及以上时显著提高ROS的产生水平以及MDA、PC和8-OHdG的含量,降低ASA和AHR的能力、GSH的含量以及抗氧化酶(SOD、CAT、GR和GSH-Px)的活性,抗氧化酶活性的降低与抗氧化酶(CuZn-SOD、CAT、GR和GSH-Px)基因表达水平的降低密切相关,肾脏发生氧化损伤,最终导致肾脏的结构和功能受损。氧化损伤是NaF诱导肾脏结构和功能损伤的作用机理之一。2.NaF对小鼠肾脏细胞周期的影响试验动物的分组及管理与1同。机体内过量的ROS可攻击DNA等生物大分子物质,造成DNA的损伤,进而引起细胞周期进程的改变。试验第21和42天对小鼠肾脏细胞周期以及周期相关调控分子的mRNA和蛋白表达水平进行了测定。流式细胞术检测结果显示,肾脏发生了G2/M期细胞周期阻滞。Western blotting和qRT-PCR的检测发现p21、Gadd45a、p53的mRNA表达水平以及p-p53、p-CDK1(Tyr15)、p21、Gadd45a的蛋白表达水平增加,PCNA、CyclinB1、CDK1、PI3K、Akt、mdm2的mRNA表达水平和PCNA、CyclinB1、mdm2、PI3K、p-Akt(Thr308)、p-Akt(Ser473)的蛋白表达水平降低。结果表明,NaF的剂量达到12 mg/kg及以上时可通过抑制PI3K-Akt-p53信号通路诱导小鼠肾脏发生G2/M期细胞周期阻滞,导致肾脏细胞的增殖和肾脏的生长发育受阻。3.NaF对小鼠肾脏细胞凋亡和自噬的影响试验动物的分组及管理与1同。细胞周期检测点在检测到细胞DNA受损之后,会将细胞阻滞于某一特定时期内,对其损伤进行修复,若修复无效则会诱导其死亡(如凋亡、自噬等)。试验第21和42天对小鼠肾脏细胞凋亡和自噬以及凋亡和自噬相关调控分子的mRNA和蛋白表达水平进行了检测。流式细胞术和TUNEL法检测发现小鼠肾脏细胞的凋亡率明显增加。qRT-PCR和Western blotting法检测发现Foxo3a、Bim、Bax、caspase 9、caspase 3、Bad、Becline1、LC3(自噬标志物)的mRNA表达水平,Foxo3a、Bim、Bax、C-caspase 9、C-caspase 3、Bad、Becline1的蛋白表达水平以及LC3-II/LC3-I的值明显升高,Bcl-2、Bcl-xL、mTOR、p70s6k、p62的mRNA表达水平以及Bcl-2、Bcl-xL、mTOR、p-p70s6k、p62的蛋白表达水平明显降低。结果表明,NaF的剂量达到12 mg/kg及以上时可通过抑制PI3K-Akt-Foxo3a/caspase9/Bad/mTOR信号通路诱导小鼠肾脏细胞发生凋亡和自噬。4.NaF对小鼠肾脏细胞炎症反应的影响试验动物的分组及管理与1同。试验第21和42天,运用生物化学、ELISA、qRT-PCR和Western blotting法测定小鼠肾脏NO和PGE_2的含量、iNOS的活性以及炎性相关因子的mRNA和蛋白表达水平。结果表明,NaF的剂量达到12 mg/kg及以上时可提高NO和PGE_2的含量、iNOS的活性和mRNA表达水平以及COX-2、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的mRNA和蛋白表达水平,降低了IL-4和IL-10的mRNA和蛋白表达水平,肾脏发生炎症反应,与病理组织学的观察结果一致。PI3K-Akt-NF-κB信号通路的抑制以及炎性细胞因子表达的改变是NaF诱导肾脏发生炎症反应的分子调控机理。综上所述,NaF的剂量达到12 mg/kg及以上时可诱导肾脏发生氧化损伤、G2/M期细胞周期阻滞、细胞凋亡、自噬以及炎症反应,最终导致肾脏的结构和功能受损。氧化损伤是NaF诱导小鼠肾脏损伤的病理基础,G2/M期细胞周期阻滞、细胞凋亡、自噬以及炎症反应的发生是NaF诱导小鼠肾脏损伤的途径,PI3K-Akt信号通路则是NaF诱导小鼠肾脏损伤的分子调控机理。同时,本文首次系统地研究了NaF对小鼠肾脏结构、功能和抗氧化能力的影响;首次从细胞水平、基因水平和蛋白水平上研究了NaF对小鼠肾脏细胞周期、凋亡、自噬和炎症反应的影响;首次探讨了PI3K-Akt信号通路在NaF致小鼠肾脏损伤中的作用及其与肾脏细胞周期阻滞、凋亡、自噬和炎症反应之间的相互作用关系。
【图文】：

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图 1-1 细胞周期示意图[59]Fig. 1-1 Schematic of cell cycleBai 等[60]在采用流式细胞术研究高氟日粮对雏鸡肾脏细胞周期的影响时发现，雏鸡肾脏 G0/G1 期的细胞数量随着日粮中氟含量的升高而呈现明显增加的趋势，表明高氟诱导了肾脏 G0/G1 期的细胞周期阻滞。Chen 等[61]的研究发现，当饮水中氟化钠的含量为50 mg/L 时会扰乱大鼠肾脏 G1/S 期和 G2/M 期的细胞周期进程，进而影响大鼠肾脏细胞的增殖。还有报道显示，当饮水中氟化钠的含量为 50 mg/L 时会明显降低大鼠肾脏 G2/M期的细胞数量[54]。这些研究结果均表明，过量的氟可引起肾脏细胞周期的阻滞，然而具体将肾脏细胞阻滞在哪个时期目前还尚无定论，仍需进一步的研究。与此同时，有关氟诱导肾脏细胞周期阻滞的机理也尚未见有报道，还需探索。2.2.3 氟与肾脏细胞凋亡

同系物,结构特征,同源结构域

们在本论文中将其称为 Akt。Akt 蛋白家族在结构上均包含位于 N 端的血小板同源结构域(pleckstrin homolgydomain，PH)、位于 C 端的调控结构域和位于中间的激酶催化结构域[101]（图 1-2）。Akt的血小板同源结构域主要介导 Akt 与 PIP3 之间的结合。Akt 的激酶催化结构域与 PKA和 PKC 的激酶结构域具有高度的相似性，在这个结构域当中存在一个苏氨酸残基(Thr308)，，该位点的磷酸化是 Akt 活化所必需的。在 Akt 的调控结构域中存在一个丝氨酸残基(Ser473)，Ser473 位点的磷酸化可使 Akt 获得更高的活性[102]。
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S859.8

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