组蛋白去乙酰化抑制剂对猪克隆胚胎核重编程的影响

发布时间：2020-03-31 12:15

【摘要】：体细胞核移植(SCNT)是一种哺乳动物生物医学研究方面的有价值的工具。但是SCNT效率一直很低,困扰着克隆猪的应用。目前认为克隆效率低的主要原因是异常的表观遗传修饰导致的。利用组蛋白去乙酰化抑制剂(HDACi),可以修正异常的表观遗传重编程,进而提高猪SCNT胚胎的体外发育能力。MGCD0103、PCI-24781、M344、Quisinostat 和 CI994 是 HDACi,他们都具有促进组蛋白乙酰化水平的能力,但是尚未在猪SCNT研究中报道。本研究是第一次使用这五种HDACi探究其对猪核移植胚胎发育的影响。方法:利用不同浓度的 HDACi(MGCD0103、PCI-24781、M344、Quisinostat和CI994)处理猪克隆胚胎24小时,找出最佳处理浓度,随后用最佳处理浓度处理不同时间,找出最佳的HDACi处理时间。确定好五种HDACi的最佳处理条件后,通过免疫荧光染色方法和PCR等方法确定猪SCNT胚胎中组蛋白乙酰化水平、DNA甲基化水平、凋亡水平以及多能性和凋亡相关基因表达水平。每种HDACi处理后的克隆胚胎将被移入待遇母猪体内,观察胎儿发育情况。结果:(1)与对照组相比,0.2 μ的MGCD0103处理猪克隆胚胎24 h可以显著提高猪SCNT胚胎的囊胚形成率(25.5%vs.10.7%;P0.05)。之后用MGCD0103处理6小时的猪SCNT胚胎使用H3K9和H4K12抗体进行免疫荧光染色。结果显示,MGCD0103处理的假原核期猪核移植胚胎中组蛋白H3K9的乙酰化水平(AcH3K9)和组蛋白H4K12的乙酰化水平(AcH4K12)均显著地高于对对照组。体内移植实验结果表明CI994处理的猪SCNT胚胎移入2头代孕母猪后,获得3个克隆胎儿。这些结果说明MGCD0103可以增强核重编程并提高猪SCNT胚胎的体外发育能力。(2)与对照组相比,0.5nM的PCI-24781处理猪克隆胚胎6小时可以显著提高猪SCNT胚胎的体外囊胚形成率(25.3%vs.10.5%;P0.05)。之后用PCI-24781处理6小时的猪SCNT胚胎使用H3K9和H4K12抗体进行免疫荧光染色。结果显示,PCI-24781处理的假原核期猪核移植胚胎中AcH3K9和AcH4K12均显著地高于对对照组。而且TUNEL结果表明PCI-24781处理可以显著抑制SCNT胚胎的凋亡的细胞数。体内移植实验结果表明PCI-24781处理的猪SCNT胚胎移入3头代孕母猪后,获得2个猪胎儿。综上所诉,PCI-24781处理可以明显提高体细胞核重编程的能力和猪SCNT胚胎的发育能力。(3)与未处理对照组相比,5 μM的M344处理猪克隆胚胎6小时可以显著提高猪SCNT胚胎的体外囊胚形成率(25.1%vs.10.9%;P0.05)。而且M344处理可以显著提高假原核期猪克隆胚胎中AcH4K12平均荧光强度。但是多能性相关基因Oct4,NANOG和SOX2的mRNA表达水平在M344处理组和未处理组之间没有显著性差异。体内移植实验结果表明CI994处理的猪SCNT胚胎移入3头代孕母猪后,获得3个克隆胎儿。综上所诉,M344处理可以提升组蛋白乙酰化水平、促进核重编程的能力并且提高猪SCNT胚胎的体外发育能力。(4)与未处理对照组相比,10 nM的Quisinostat处理猪克隆胚胎24小时可以显著提高猪SCNT胚胎的体外囊胚形成率(19.0%vs.10.2%;P0.05)。而且Quisinostat处理可以显著提高假原核期猪克隆胚胎中AcH3K9平均荧光强度。同样,免疫荧光结果证实Quisinostat处理可以明显促进猪核移植囊胚中POU5F1的表达水平。PCR结果证明Quisinostat处理明显提升了 BCL2的mRNA表达水平,但是BAX的mRNA表达水平没有显著性差异。体内移植实验结果表明Quisinostat处理的猪SCNT胚胎移入3头代孕母猪后,获得6个猪克隆胎儿。综上所诉,Quisinostat处理可以调整表观遗传修饰、促进核重编程,进而提高猪SCNT胚胎的发育能力和囊胚质量。(5)与对照组相比,10μ 的CI994处理猪克隆胚胎24小时可以显著提高猪SCNT胚胎的囊胚形成率(21.9%vs.11.4%;P0.05)。虽然CI994处理可以显著提高假原核期猪核移植胚胎中AcH3K9和AcH4K12的平均荧光强度,但是在囊胚期中AcH3K9和AcH4K12的平均荧光强度没有显著性差异。免疫荧光结果证明CI994可以显著促进SCNT囊胚中POU5F1的表达,但不影响5mC的平均荧光强度。TUNEL结果表明CI994处理可以显著抑制SCNT胚胎的凋亡的细胞数。PCR结果表明多能性相关基因POU5F1和SOX2的mRNA表达水平在CI994处理组中显著高于未处理组。体内移植实验结果表明CI994处理(10 μM for 24 h)的猪SCNT胚胎移入3头代孕母猪后,获得3个猪胎儿。综上所诉,CI994处理可以提升组蛋白乙酰化水平、增强体细胞核重编程的能力,进而提高猪SCNT胚胎的体外发育能力。结论:组蛋白去乙酰化抑制剂MGCD0103(0.2μM,24小时)、PCI-24781(0.5 nM,6 小时)、M344(5 μM,6 小时)Quisinostat(10 nM,24 小时)及 CI994(10μM,24小时)处理猪核移植克隆胚胎可以显著增强组蛋白乙酰化水平、抑制细胞的凋亡、促进多能性相关基因的表达、提高体细胞核重编程能力和体外发育能力。
【图文】：

囊胚,体外培养,胚胎

ＭＧＣＤ０１０３处理后的第７天的猪ＳＣＮＴ囊胚。。（Ｂ）第７天的猪ＳＣＮＴＩＩ胚经Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２１００邋ｊｉｍ。（Ｃ）第７天的猪ＳＣＮＴＪＩ胚经Ｐ丨染０邋ｐｍ。（Ｄ）第７天的猪ＳＣＮＴ囊胚合并后的图０邋ｉｎｍ。逡逑ｙ邋７邋ｐｏｒｃｉｎｅ邋ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ邋ｄｅｒｉｖｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ｔｈｅ邋ＭＧＣＤｆｉｃａｔｉｏｎ，邋１００．邋Ｓｃａｌｅ邋ｂａｒ邋＝邋１００邋ｆｉｍ．邋（Ｂ）邋Ａ邋Ｄａｙ邋７ｅｃｈｓｔ邋３３３４２．邋Ｏｒｉｇｉｎａｌ邋ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ，邋２００．邋Ｓｃａｌｅ邋ｂｆｔｅｒ邋ＳＣＮＴ邋ｓｔａｉｎｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＰＩ．邋Ｏｒｉｇｉｎａｌ邋ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ａ邋ｐｏｒｃｉｎｅ邋ＳＣＮＴ邋ｅｍｂｒｙｏ邋００．邋Ｓｃａｌｅ邋ｂａｒ邋＝邋１００邋＾ｍ．逡逑胚胎经过电激活后，用０．２邋ｐＭ的ＭＧＣＤ同的时间（Ｏｈ、６邋ｈ、２４邋ｈ、４８邋ｈ，其中ＯＭＧＣＤ０１０３的体外培养液，继续培养，，

乙酰化程度,组蛋白,遗传标志,处理组

同样为了解释提高猪克隆胚胎的体外发育能力的机制，当猪核移植逡逑胚胎发育到假原核期时，另一个表观遗传标志位点ＡｃＨ４Ｋｌ２的强度也被逡逑通过免疫荧光方法检测了。图３．３证明表观遗传标志位点ＡＣＨ４Ｋ１２的平逡逑均强度在０．２邋的ＭＧＣＤ０１０３处理组明显地高于０邋ｇＭ的ＭＧＣＤ０１０３逡逑处理组。逡逑２５逡逑
【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S828;Q813

【参考文献】