鸡毒支原体GroEL蛋白诱导PBMC凋亡的机制及其在诊断应用中的价值

发布时间：2020-03-31 14:34

【摘要】：鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)是引起鸡慢性呼吸道疾病的病原体,感染MG的鸡群主要表现为咳嗽、鼻炎、喷嚏、气管Up音等呼吸道症状;鸡群感染MG后对其它病原菌易感性增加,引起继发感染,产生更为严重的呼吸道综合征,从而给养禽业造成巨大经济损失。目前MG的致病机制的研究还不够深入,防控技术水平比较薄弱,MG在养禽场中的平均感染率高达70%~80%。因此,开展MG致病机制的研究并探索其有效免疫原蛋白具有重要意义。支原体没有细胞壁,细胞膜是它与外界接触的主要结构,膜表面存在大量脂质相关膜蛋白(Lipid-associated membrane proteins,LAMPs)。本实验室前期研究鉴定GroEL蛋白为鸡毒支原体脂质相关膜蛋白LAMPs的组分,并且其可引起DF-1细胞凋亡。但DF-1细胞为传代细胞系,并不能真实体现机体免疫系统的损伤。因此本研究分离鸡外周血淋巴细胞(peripheral blood monouclear cells,PBMC),以PBMC作为细胞模型,探究GroEL蛋白诱导PBMC凋亡情况。首先构建GroEL的重组表达质粒,然后表达并纯化出rGroEL蛋白,通过流式细胞仪和Western blot技术检测rGroEL蛋白诱导PBMC凋亡情况。结果显示:PBMC的凋亡率随着rGroEL蛋白剂量的增加而升高,凋亡相关因子caspase3/8/9均升高,表明rGroEL蛋白可以诱导PBMC凋亡。为进一步研究rGroEL蛋白诱导PBMC凋亡的分子机制,本实验室前期初步筛选出鸡膜联蛋白A2(Annexin A2)可以与GroEL蛋白相互作用,本研究为了证实rGroEL蛋白引起PBMC的凋亡是否与Annexin A2有关,将rGroEL蛋白加入PBMC培养基中孵育,分别加入抗GroEL蛋白和抗Annexin A2蛋白的单抗后,然后用荧光二抗进行标记后经激光共聚焦显微镜观察,结果表明rGroEL蛋白可以与PBMC中内源性Annexin A2共定位于细胞膜表面。Western blot检测表明:用rGroEL蛋白刺激PBMC后Annexin A2蛋白表达量增加;用siRNA干扰表达Annexin A2蛋白的mRNA后再用rGroEL蛋白刺激,流式细胞仪分析结果表明:干扰Annexin A2表达可以降低rGroEL蛋白诱导PBMC的凋亡率。以上结果表明,鸡毒支原体GroEL蛋白可以通过Annexin A2诱导PBMC凋亡。鉴于GroEL蛋白的重要作用以及其为MG重要的免疫原,为研究GroEL蛋白是否可以作为诊断抗原,本研究以rGroEL蛋白作为包被抗原初步建立了间接ELISA检测方法,经验证其敏感性较好,并且与滑液囊支原体(Mycoplasma Synoviae,MS)阳性血清无交叉反应性。然而当用本研究中建立的间接ELISA检测方法与商品化的MG抗体检测试剂盒对同一批样品进行检测时发现,两者的符合率仅为63.34%。因此本研究中的rGroEL蛋白作为MG诊断抗原有待进一步验证。
【图文】：

蛋白刺激 PBMC 后置刺激组和对照组，设三个重复。在 12 h 液，置于冰上裂解30 BCA 蛋白定量，剩余胶各加样口中加入等量 的脱脂乳中封闭 2 h， 和 β-actin 的一抗，3抗，37℃孵育 45 min，设计的 groEL 上下游1605 bp 相吻合。M 1 20 bp

M 1组质粒 pET-30a- groEL nant plasmid pET-30a- grker; 1: pET-30a- groEL 1: pET-30a- groEL diges21 感受态细胞，进得到了表达，，且大M 1 bp bp bp bp5 kDa kDa
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.31

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本文编号：2609205