抗菌肽类似物JH-3抵御沙门氏菌感染的作用机制研究

发布时间：2020-03-31 17:45

【摘要】：近年来,由于传统抗生素滥用,导致临床上多种耐药菌株、超级细菌层出不穷。因此,寻找抗生素替代品迫在眉睫。抗菌肽是生物体抵抗外来微生物入侵时产生的一类防御性小肽,是机体先天免疫系统的重要组成部分。与传统抗生素相比,抗菌肽具有分子量小、水溶性好、热稳定性好、抗菌机理独特、对临床耐药菌株具有广谱抗菌活性,且不易诱发细菌产生耐药性等特点。本研究,以本课题组从牛红细胞血红蛋白α亚基中分离到的抗菌肽P3类似物抗菌肽JH-3、沙门氏菌CVCC541为研究对象,对抗菌肽JH-3抵御沙门氏菌感染的效果开展以下工作:通过对抗菌肽JH-3活性检测和MIC测定,确定抗菌肽JH-3对沙门氏菌CVCC541最小抑菌浓度为100μg/mL。抗菌肽JH-3杀菌动力学研究,结果表明抗菌肽JH-3在5 h内具有良好的杀菌活性,且杀菌作用呈剂量依赖性增强。细菌通透性研究表明抗菌肽JH-3能够改变细菌的通透性,利用扫描电子显微镜和透射电子显微镜进行细菌形态学观察,发现细菌形态发生皱缩,膜完整性被破坏。抗菌肽JH-3能够使细菌膜通透性增加,导致菌内容物外泄。以上结果表明,抗菌肽JH-3具有良好的体外杀菌活性。沙门氏菌CVCC541感染BALB/c小鼠模型的建立,本试验选取感染对象为20 g BALB/c雌性小鼠,随机分成5组,每组10只,分别腹腔注射1ⅹ10~7CFU/mouse、1ⅹ10~6 CFU/mouse、1ⅹ10~5 CFU/mouse、1ⅹ10~4 CFU/mouse的沙门氏菌CVCC541,第5组为PBS对照组。结果表明,沙门氏菌CVCC541感染小鼠临床症状严重程度与感染剂量和时间呈正相关,1ⅹ10~7 CFU/mouse感染小鼠4d内全部死亡,1ⅹ10~6 CFU/mouse感染小鼠1周内全部死亡,1ⅹ10~5 CFU/mouse呈现出20%的死亡率和1ⅹ10~4 CFU/mouse未见死亡,小鼠感染沙门氏菌CVCC541后表现出被毛松乱、精神萎靡、食欲下降、喜欢聚集,弓背等症状。剖检结果显示病理变化严重程度与感染剂量也呈正相关,病变以小肠为主,肠壁变薄,肠内出血严重,尤其是空肠和回肠,感染小鼠脾脏嗜中性粒细胞显著增加,巨噬细胞和T淋巴细胞显著降低。根据以上结果,筛选出1ⅹ10~6 CFU/mouse作为小鼠模型建立的最佳感染剂量,为后续抗菌肽JH-3进行治疗性试验奠定基础。为探究抗菌肽JH-3抵御沙门氏菌CVCC541感染小鼠的治疗效果,本实验选取感染对象为20 g BALB/c雌性小鼠,随机分成8组,每组10只,分别为PBS阴性对照组、CVCC541感染组、CVCC541+Ciprofloxacin(40 mg/kg,2 h)治疗组、CVCC541+JH-3(40 mg/kg,2 h)治疗组、CVCC541+JH-3(10 mg/kg,2 h)治疗组、CVCC541+Ciprofloxacin(40 mg/kg,P 3 d)治疗组、CVCC541+JH-3(10 mg/kg,P3 d)治疗组、CVCC541+JH-3(40 mg/kg,P 3 d)治疗组。分别以40 mg/kg和10 mg/kg的抗菌肽JH-3剂量在感染小鼠后2 h和3 d进行腹腔注射治疗,结果发现感染BALB/c小鼠后2 h治疗效果优于沙门氏菌CVCC541感染后3 d进行JH-3治疗的效果,可显著保护小鼠免受致死剂量沙门氏菌CVCC541的攻击,小鼠存活率高达100%,临床症状评分,血液和脏器荷菌数降低,小肠肠道病理变化减轻,脾脏中性粒细胞比例降低,巨噬细胞和T淋巴细胞比例增加,均趋于正常值。而感染3 d后的治疗效果均较差。本实验首次将抗菌肽JH-3用于沙门氏菌CVCC541的治疗性效果研究,且对不同剂量和不同治疗时间效果进行评价,为后期新型抗菌药物的研究奠定基础。为探索抗菌肽JH-3抵御沙门氏菌CVCC541对RAW264.7侵袭的作用机制,将沙门氏菌CVCC541以MOI为10感染RAW264.7,建立沙门氏菌感染RAW264.7细胞模型,在细胞模型上评价抗菌肽JH-3(终浓度100μg/mL)对细胞的效果,采用透射电子显微镜观察,发现抗菌肽JH-3作用后细胞质均匀,细胞形态完整。为进一步探索抗菌肽JH-3的抗感染机理,深入研究JH-3抗炎和抗细胞凋亡的分子机制,将抗菌肽先1h作用细胞,后沙门氏菌CVCC541以MOI为10感染RAW264.7,作用12 h后收集细胞上清和细胞总蛋白,ELISA检测细胞上清炎性细胞因子,并提取细胞RNA和总蛋白进行荧光定量RT-PCR和WB分析。结果表明,抗菌肽JH-3可以通过抑制p38MAPK信号通路降低沙门氏菌感染介导的炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α的释放,表明抗菌肽JH-3具有良好的抗炎效果,激光共聚焦和流式细胞仪检测进一步证实抗菌肽JH-3还可以有效抑制caspase-3和caspase-8的活化,从而降低沙门氏菌诱导的巨噬细胞凋亡。
【图文】：

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并且能够与细胞膜平行，在各种作用力下，抗菌肽最终以“去垢剂”的形式通过使细菌细胞膜破坏后，使细菌发生死亡。图1-1 抗菌肽的杀菌方式[10]Fig. 1-1 Sterilization of antimicrobial peptidesSu Jin Ko等在膜模拟环境下利用圆二色性测定抗菌肽Macropin的结构为α螺旋结构，发现抗菌肽Macropin通过破坏细胞膜与肽聚糖、LPS相结合，导致细菌死亡[11]。Valeriy Domenyuk等将抗菌肽进行膜标记之后，，研究抗菌肽synbody对金黄色葡萄球菌（UAB637）的作用方式，使用激光共聚焦显微镜进行结果观察，

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通过 MIC 测定发现 JH-3 对沙门氏菌 CVCC541 的最小抑菌浓度为 100 μg/mL（图2-1 B）。图 2-1 抗菌肽 JH-3 抑菌活性和 MIC 测定Fig. 2-1 Antimicrobial activity of antimicrobial peptides JH-3 and MIC determinationA：抗菌肽 JH-3 对沙门氏菌 CVCC541 的抑菌结果；B:抗菌肽 JH-3 对沙门氏菌 CVCC541最小抑菌浓度检测结果A:Results of antibacterial peptide JH-3 against Salmonella CVCC541; B:Minimal inhibitoryconcentration of antimicrobial peptide JH-3 against Salmonella CVCC5412.2 杀菌动力学检测结果为检测抗菌肽 JH-3 对沙门氏菌 CVCC541 的杀菌活性，测定了细菌培养物的 OD600值，发现抗菌肽 JH-3 作用 5 h 后细菌培养液 OD600降低至 0.4，极显著低于对照组（图 2-2 A，p＜0.001）。对抗菌肽 JH-3 作用后沙门氏菌 CVCC541活菌数量进行测定，发现抗菌肽 JH-3 对沙门氏菌 CVCC541 的杀菌效率呈现出MIC 依赖性增加，且 1MIC 的抗菌肽 JH-3 与对沙门氏菌 CVCC541 作用 4 h 可使细菌数量降低 1000 倍（图 2-2 B，p＜0.001）
【学位授予单位】：河南科技学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S859.7

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