猪繁殖与呼吸综合征病毒解旋酶的结构解析及功能研究

发布时间：2020-04-01 23:29

【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是危害养猪业最严重的病原体之一,每年给全球养猪行业造成巨大的经济损失,至今无有效的药物。2006年,我国爆发了高致病性的猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV),其毒力增强与RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp,nsp9)和解旋酶(Helicase,nsp10)的变异有关,但具体的分子机制尚不清楚。此外nsp9与nsp10是PRRSV复制转录复合体(RTC)最重要的组成部分,但其参与复制的分子机制仍未阐明。本研究通过晶体学方法解析了动脉炎病毒科PRRSV解旋酶的首个全长结构,揭示了一种1B结构域走向不同的全新构象,并首次展示了C末端结构域的三维构象。进一步通过生化实验验证了1B结构域在解旋酶与核酸底物结合过程中发挥着重要的作用,及C末端结构域对ATPase活性具有重要影响。本研究为阐释nsp10参与病毒复制的分子机制及药物设计提供了新思路。具体工作内容如下:1.PRRSV nsp10结构解析。原核表达纯化PRRSV nsp10可溶性蛋白,通过晶体初筛及优化获得了高分辨率的晶体,并利用X-Ray衍射收集收据并解析了分辨率为3.0?的晶体结构。PRRSV nsp10是由三个结构域组成的单体:N端锌指结构域(ZBD)、非特征性1B结构域及C端解旋酶核心结构域。我们发现PRRSV nsp10 1B结构域走向与其他解旋酶不同,将其与已有结构的SF1家族解旋酶进行比较发现1B极具柔性且其在序列和结构上的位置也有较大的变动,它并非是解旋酶必须存在的结构域。我们从结构上揭示了PRRSV nsp10 1B结构域走向不同的原因在于1B上第126位亮氨酸(L)和第128位苏氨酸(T)分别与ZBD上第19位丙氨酸(A)和第20位半胱氨酸(C)及1A结构上第129位半胱氨酸(C)形成了氢键作用力。另外本文首次展示了动脉炎病毒科解旋酶C末端结构域是由三个β-sheet和两个相互垂直的α-helix组成,该规整性结构提示了该区域在行使功能过程中可能发挥着重要作用。2.PRRSV nsp10 1B结构域与C末端结构域的功能研究。为了研究1B结构域与C末端结构域与功能的关系,我们构建了nsp10Δ1B、nsp10 1-389重组质粒,并纯化了相应可溶性蛋白。首先利用EMSA方法检测了nsp10Δ1B蛋白与dsDNA和dsRNA的结合力,结果表明nsp10Δ1B与dsDNA结合力相比于野生型蛋白降低了约50%;ATPase活性虽有所减弱但不会完全丧失;Helicase活性检测结果表明1B缺失蛋白与野生型蛋白不存在显著性差异,揭示了1B结构域主要功能是与核酸底物的结合。同样,为了研究nsp10 C末端结构域与功能的关系,我们检测nsp10 1-389蛋白的ATPase和Helicase活性,结果表明C末端结构域的缺失完全丧失了ATPase的活性,但解旋功能几乎不受影响。说明PRRSV nsp10 C末端结构是ATPase活性发挥的必要组件。
【图文】：

解旋酶,家族

2图 1.1 解旋酶的分类(Singleton et al 2007)Fig 1.1 The classification of Helicase认识 SF1、SF2 家族解旋酶，研究学者基于序列分1 家族解旋酶细分为三个家族 UvrD/Rep、Pif1-like 和九个家族 RecG-like、RecQ-like、Rad3/XPD、Ski2、DEAD-box、DEAH/RHA 和一个亚组 NS3/NPH-Ⅱ旋酶最经典的解旋酶是真核生物解旋酶 Upf1，这类解旋：其一是 N 端具有非常保守的特征性结构域：半胱），即锌指结构域（ZBD）。该区域不仅影响 ATPase2 的结合(Kadlec et al 2006, Chamieh et al 2008)。真核

解旋酶

猪繁殖与呼吸综合征病毒解旋酶的结构解析及功能研究管途径可以快速检测并降解含有 PTC 的 mRNA，，即无义 mRNA 降解途D 通路）(Isken and Maquat 2007)。在酿酒酵母和秀丽隐杆线虫中发现 NMD心成分是 Upf1、Upf2 和 Upf3(Leeds et al 1992, Page et al 1999)，且 NMD 过步都需要 Upf1 解旋酶的参与（图 1.3）。另一个保守结构域是 C 端的 RecA-，这个结构域包含了由 Walker Amotif 形成的磷酸盐结合 loop（P-loop）以r B motif 形成参与 ATP 水解的精氨酸手指域(Gorbalenya and Koonin 1manya et al 1996, Korolev et al 1997)。除了这两大保守的核心结构外，Upf一般也包含辅助催化活性及与其他蛋白相互作用的其他配件结构eton and Wigley 2002, Singleton and Dillingham 2007)。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.651

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