基于转录组测序的沙葱萤叶甲成虫夏滞育分子机理的研究

发布时间：2020-04-02 01:47

【摘要】：沙葱萤叶甲Galeruca daurica(Joannis)是近年来在内蒙古草原上猖獗成灾的一种新害虫,以成虫滞育越夏,以卵滞育越冬。滞育在提高昆虫生存能力方面扮演着重要角色,但目前对沙葱萤叶甲滞育的机理还一无所知。本研究利用RNA-Seq技术对沙葱萤叶甲成虫滞育前期(pre-diapause)、滞育期(diapause)和滞育后期(post-diapause)3个阶段进行了转录组测序,筛选了滞育相关基因,并对3个滞育相关基因的分子特性与表达谱进行了研究。同时,测定了成虫滞育不同阶段主要生理生化指标,以期揭示沙葱萤叶甲成虫夏滞育的分子机理,为进一步揭示其成灾机制及综合治理提供必要的基础。主要研究结果如下:1.明确了沙葱萤叶甲成虫滞育不同阶段主要生理生化指标的变化特点。在滞育前后水分和总蛋白含量较高,滞育期间含量较低,说明沙葱萤叶甲成虫滞育期间代谢活动较低;而脂肪和糖原含量的趋势与之相反,说明脂肪和糖原是沙葱萤叶甲成虫滞育期间的主要能源物质。海藻糖含量在滞育不同阶段波动较大,海藻糖含量的高低与沙葱萤叶甲在滞育不同阶段的能量需求及转换有密切关系。2.利用Illumina HiSeq2500测序平台,组装得到82,292个Unigenes。通过比对滞育前期-滞育期,共发现差异基因3,099个,主要富集于新陈代谢、碳水化合物代谢和脂肪代谢等分子功能类别;滞育期-滞育后期比对时,则发现81个差异基因,主要富集于脂肪生物合成、脂肪代谢调控和细胞脂肪代谢等分子功能类别。为了验证RNA-Seq数据,选取11个特异性表达基因进行qRT-PCR验证。结果显示,qRT-PCR和RNA-Seq结果表达趋势一致。3.海藻糖酶(trehalase,Tre)作为昆虫体内海藻糖代谢的关键性酶,在昆虫能量调节和生长发育中具有重要作用。通过RACE技术,克隆获得1条沙葱萤叶甲可溶性海藻糖酶(GdTre1)基因序列。该基因cDNA全长1,933 bp,其中ORF长1,704bp,共编码567个氨基酸;蛋白预测分子量66.56 kD,等电点6.62;编码蛋白具有海藻糖酶超基因家族典型的功能结构域,包含1条信号肽,不具有跨膜结构。同源序列比对和系统发育分析表明,GdTre1与马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata Tre1b的同源性最高,氨基酸序列一致性达70.25%。qRT-PCR检测结果表明,GdTre1在沙葱萤叶甲各发育阶段均有表达,其中在卵期和成虫滞育期间高表达,而在幼虫、预蛹、蛹及成虫滞育前低表达;在成虫不同组织中,通常在腹部表达量最高,其次为胸部,最低为头部;GdTre1表达量随着温度升高而上升,30℃达最高值,而后随温度升高略有下降。沙葱萤叶甲不同日龄成虫体内GdTre1表达量及Tre活性均存在显著差异,且GdTre1表达量与Tre活性变化趋势一致。以上结果表明,海藻糖酶与沙葱萤叶甲生长发育和成虫夏滞育有密切关系,该结果为进一步揭示昆虫夏滞育的分子机理提供了必要的基础。4.热激蛋白(heat shock poteins,Hsps)是一种生物体细胞在外界不利环境条件刺激下诱导产生的一种蛋白质。Hsps被认为是与滞育关系最为密切的基因。通过RACE技术,克隆得到沙葱萤叶甲热激蛋白10基因(GdHsp10a)的cDNA序列。序列分析表明,GdHsp10a基因的cDNA全长为526 bp,其中ORF为333 bp,编码110个氨基酸,预测蛋白分子量11.97 kD,等电点9.74;无信号肽,不含跨膜结构。多重序列比对及系统进化分析结果表明,GdHsp10a与光肩星天牛Anoplophora glabripennis亲缘关系最近,氨基酸序列一致性为53.15%。qRT-PCR结果显示,GdHsp10a基因在沙葱萤叶甲各发育阶段均有表达,其中在卵期和成虫期的表达量显著高于幼虫期、预蛹期及蛹期;成虫羽化第25 d时表达量最高,其次为100、10和7 d;温度对GdHsp10a表达量有显著影响,30℃条件下表达量最高,其次为35℃,15、20、25及40℃条件下表达量最低且无显著差异。上述结果表明,GdHsp10a可能在沙葱萤叶甲生长发育及成虫夏滞育中起着多重作用,本研究为进一步研究该基因的功能奠定了基础。5.保幼激素(juvenile hormone,JH)在昆虫滞育的调控中扮演着重要角色。保幼激素结合蛋白(juvenile hormone binding protein,JHBP)在JH的保护和运输中具有重要作用。通过RACE技术,克隆得到沙葱萤叶保幼激素结合蛋白(GdJHBP)基因的cDNA序列。cDNA全长826 bp,其中ORF为714 bp,共编码237个氨基酸;蛋白质预测分子量26.58 kD,等电点4.37;编码蛋白具有JHBP超基因家族典型的功能结构域,发现1条信号肽,无跨膜区。同源序列比对和系统发育分析结果表明,GdJHBP与同为鞘翅目的马铃薯甲虫JHBP 3p2亲缘关系最近,氨基酸序列一致性为30%。qRT-PCR检测结果表明,GdJHBP在沙葱萤叶甲卵期、蛹期低表达,而在幼虫期及成虫期高表达;在成虫不同组织中,在腹部和胸部表达量最高,其次是头部;温度显著影响GdJHBP基因的表达,35℃时表达量最高,而后下降。以上结果表明,GdJHBP蛋白在沙葱萤叶甲的生长发育和夏滞育中发挥着重要作用,该结果为进一步揭示昆虫夏滞育的分子机理提供了必要的基础。
【图文】：

原理图,转录组,测序,原理

内基因的动态转录水平，细胞内稀有、正常转录本也可被鉴定和定量，还品中某些特异的转录本序列结构信息。利用 Ploy（A）结构提取待测样，随机打断后，经反转录为 cDNA 后进行测序（图 1）。如测序物种已有基 RNA-Seq 结果与基因组序列信息比对分析，来获取基因表达、可变剪切优化等结果，还可发现新基因；但是对于没有基因组的物种，则可通过从novo）的方法进行转录组测序，即对测序所得的片段进行从头组装，从种的基因序列集（unigenes）数据[199]，基于此序列信息，可以进行后续的分析，包括基因结构注释、基因表达量分析和基因功能注释等，为生物学因序列信息，为后续分子水平的研究奠定基础。第二代测序技术，又称新一代测序技术(next-generation sequencing tech)，因其有别于第一代测序技术的 Sanger 测序法而得名。相较于传统的 Sa术，第二代测序技术除了能够出色地完成常规测序，还能够应用于常规测的领域。目前，推出的测序平台有 454、Illumina、Solid 以及 Ion Torrent。

糖原含量,沙葱,总糖,滞育

B：脂肪含量2.3.2 沙葱萤叶甲成虫不同滞育阶段的总糖、海藻糖及糖原含量从图4可知，总糖含量在滞育期极显著低于滞育前和滞育后（F=15.22，P<0.001），而糖原含量正好相反，并且总糖和糖原含量在滞育期间（羽化后 7～60 d）无显著差异（P＜0.05）。海藻糖含量在沙葱萤叶甲成虫滞育不同阶段变化较大，滞育前期（羽化后 3 d）海藻糖含量高达 23.75 μg/mg，，急剧下降至羽化后（7 d 和 10 d）的 11.12 μg/mg和 11.58 μg/mg，5 d 后又恢复至滞育前期的水平
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S812.6

【参考文献】