猫免疫缺陷病毒P24蛋白的表达及免疫原性分析

发布时间：2020-04-02 04:36

【摘要】：猫免疫缺陷病毒(Feline immunodeficiency virus,FIV)和人类免疫缺陷病毒同属反转录病毒科,慢病毒属成员,主要引起猫科动物的免疫缺陷疾病。感染了猫免疫缺陷病毒的个体可以在数年内无任何症状,在其发病初期主要表现为发热、腹泻、淋巴结肿大、白细胞中的中性粒细胞减少、口腔炎症、鼻炎、食欲不振及体型瘦弱。FIV感染发生在全世界范围,自1985年首次发现以来,己在美国、日本、加拿大等国流行。猫艾滋病病毒有较强突变性,不同地区分离的毒株均有差异。本实验以猫免疫缺陷病毒阳性全血所提DNA为材料,对FIV gag基因p24片段进行分子克隆、原核及真核表达和多克隆抗体制备,为后期FIV血清学检测方法的建立奠定一定基础。本实验取得结果如下:根据GenBank上猫免疫缺陷病毒全基因RNA序列(Accession:NC_001482.1),设计了 p24蛋白编码区的一对引物,首先从血清学检测为阳性的猫血液样本中提取总RNA经反转录成cDNA后,再利用PCR方法扩曾p24基因,成功获得了 622bp的目的片段,编码207个氨基酸,经测序后与GenBank提供的序列同源性达到98%。亚克隆后酶切及PCR验证正确后将带粘性末端的目的片段连接到表达载体pET-28a(+),成功构建pET-28a-p24重组原核表达质粒。重组质粒转化BL21(DE3),经SDS-PAGE和免疫印迹(Western-blot)鉴定显示重组蛋白主要以包涵体形式表达,且能够与抗His标签小鼠单克隆抗体发生反应,证明本实验构建的原核表达载体能够成功表达p24蛋白。原核表达重组菌经过大量诱导表达后,利用切胶电洗脱纯化获得p24蛋白,纯化的p24蛋白与等量弗氏完全佐剂充分混合后对小鼠进行腹腔注射。之后用弗氏不完全佐剂混合纯化蛋白进行另外三次加强免疫,总共四次免疫后获得了具有较高特异性的多克隆抗体。通过间接ELISA方法检测多克隆抗体效价,结果显示效价可达1:51200。为了能够将目的片段连接到pCMV-HA真核表达载体,需要设计一组具有不同酶切位点的引物。将亚克隆鉴定正确的目的片段连接到pCMV-HA载体,构建p24基因真核表达载体pCMV-HA-p24。通过脂质体介导法将重组质粒转染到HEK-293T细胞中。经空载体转染的HEK-293T细胞作为对照组,Western-blot方法检测p24蛋白的免疫学活性。此部分实验成功构建pCMV-HA-p24真核表达载体,构建正确的重组质粒经脂质体介导转染HEK293T细胞,免疫荧光检测结果显示筛选出的HEK-293T-p24细胞系大多数细胞能够显示绿色荧光而作为对照的HEK-293T细胞则不显示荧光,能够说明p24蛋白在HEK-293T-p24细胞系中成功且高效表达。真核表达的特点是所表达的蛋白一旦表达成功即拥有相应的生物学活性,所以真核表达的p24蛋白在本实验用作检测鼠源多克隆抗体特异性的检测蛋白。
【图文】：

序列,片段,亚克隆,目的

以ＦＩＶ阳性流浪猫的全血提取的总ＲＮＡ反转录所得的ｃＤＮＡ为模板，设计了一组逡逑带酶切位点的特异性引物，成功扩增出了邋ＨＶ邋ｇａｇ基因ｐ２４片段。片段大小６２２邋ｂｐ，条逡逑带位置符合目的片段大小。电泳结果见图３－１。逡逑Ｍ邋１逦２逡逑ｒ＇Ｄ邋３邋＇逡逑■ＩsE逡逑７５０邋ｂｐ逡逑５００邋ｂｐ逦４６２２邋ｂｐ逡逑２５０邋ｂｐ邋ｔ逡逑１００邋ｂｐ逡逑Ｍ．邋ＤＮＡＭａｒｋｅｒ邋（ＤＬ２０００），，ｌ．ＰＣＲ邋产物，２．阴性对照逡逑图３－１邋ｐ２４基因的ＰＣＲ扩增结果逡逑Ｆｉｇ．３－１邋Ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐ２４邋ｇｅｎｅ逡逑３．１．１．２亚克隆重组质粒的鉴定逡逑将ＰＣＲ扩增得到的目的片段连接到克隆载体ｐＭＤｌ８－Ｔ上，亚克隆组质粒经限制逡逑性核酸内切酶ＥｃｏＲＲＳａｌｌ双酶切后成功获得了邋６２２邋ｂｐ的目的片段和２６９２邋ｂｐ的载体片逡逑段，电泳结果见图３－２。对重组质粒进行测序的结果显示０的片段序列与Ｇｅｎ邋Ｂａｎｋ提供逡逑的参考序列完全匹配，无缺失与突变。逡逑ｓ：：：逡逑Ｍ．邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ邋（ＤＬ５０００）邋，邋１邋？邋２．载体片段与目的片段逡逑－２３－逡逑

亚克隆,重组质粒,原核表达,片段

逡逑图３－２亚克隆Ｍ组质粒双＿切鉴定逡逑Ｆｉｇ．３－２邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｓｕｂｃｌｏｎｅｄ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ｐｌａｓｍｉｄｓ邋ｂｙ邋ｄｏｕｂｌｅ邋ｅｎｚｙｍｅ邋ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ逡逑Ｍ组质粒ＰＣＲ鉴定结果见图３－３。逡逑Ｍ邋１逡逑２°。°邋ｂＰ逡逑１０００邋＾逡逑７５０邋ｂＰ逦．逦６２２邋ｂｐ逡逑５邋００邋ｂｐ邋ＭｗＨｆｒｆｆ－－邋■，逡逑２５°ｂｐ逡逑１００邋ｂｐ逡逑Ｍ．ＤＮＡＭａｒｋｅｒ邋（ＤＬ２０００）邋，邋Ｉ．质粒邋ＰＣＲ邋产物逡逑图３－３亚克隆重组质粒ＰＣＲ鉴定逡逑Ｆｉｇ．３－３邋Ｔｈｅ邋ＰＣＲ邋ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｓｕｂｃｌｏｎｅｄ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ｐｌａｓｍｉｄ逡逑３．１．２原核表达重组质粒的酶切鉴定逡逑原核表达重组质粒ｐＥＴ－ｐ２４经限制性核酸内切酶ＥｃｏＲＩ＋Ｓａｌｌ双酶切后成功获得了逡逑６２２邋ｂｐ的目的片段和５３６９邋ｂｐ的载体Ｋ段，电泳结果见图３－４。结果表明目的片段正确逡逑连入原核表达载体。逡逑Ｍ邋１逦２逡逑７Ｓ５000ｂｂＰｐｆｅ＾Ｈ＾２２ｂｐ逡逑Ｍ．ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ邋（ＤＬ５０００）邋，邋１．２．载体片段与目的片段逡逑图３－４原核表达重组质粒ｐＥＴ－ｐ２４的双酶切鉴定逡逑Ｆｉｇ．３－２邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋ｐＥＴ－ｐ２４邋ｂｙ邋ｄｏｕｂｌｅ邋ｅｎｚｙｍｅ邋ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ逡逑－２４－逡逑
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65

【参考文献】