安乃近单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的初步建立

发布时间：2020-04-04 06:14

【摘要】：安乃近(Dipyrone)又名罗瓦尔精,是一种吡唑酮类的解热镇痛抗炎药,使用至今已有近百年的历史。近年来,各类药品的毒副作用渐渐引起人们的注意,自上世纪七十年代以来各国对安乃近的临床深入研究发现,在使用人群中有大量患者的毒副作用较为严重,甚至危及生命。因此,许多发达国家开始渐渐减少安乃近的使用直至禁用,尽管如此,部分地区安乃近的使用量依然很大。我国早在1982年就将复方安乃近片列为禁止使用的药品,但安乃近片剂及注射剂等至今仍在使用。针对日趋严重的动物性食品兽药残留问题,如何筛选含有残留物的动物性食品,避免其进入市场至关重要,其中检测分析手段是必不可少的一环。目前针对安乃近及其代谢产物残留的分析方法主要是一些理化分析法,这些检测方法虽准确性高、特异性强但需要使用的仪器价格昂贵、样品前处理过程复杂、操作复杂、耗时长、且对操作人员的专业水平有一定要求,无法在基层机构普及。而免疫学检测法是基于抗原抗体特异性反应原理的一种快速检测分析方法,相比于理化分析法,该方法使用方便,检测过程快速高效,检测结果准确,适用于大量样本的检测。本试验旨在建立一种快速检测安乃近残留的免疫学分析方法,为安乃近在动物源性食品残留监控及检测上提供科学依据。1.安乃近人工抗原的制备及鉴定安乃近进入机体后迅速分解,血浆中无法检测出安乃近原型药成分,故本试验针对安近的代谢产物4-氨基安替比林进行研究。4-氨基安替比林是小分子化合物,本试验采取戊二醛两步合成法将4-氨基安替比林分别与载体牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联制备出了两种人工抗原,分别作为免疫原(AA-BSA)和包被原(AA-OVA)。经紫外分光光度法与免疫学方法进行判定,结果证明人工抗原偶联成功。2.安乃近单克隆抗体的制备及鉴定使用人工抗原AA-BSA作为免疫原接种小鼠,在第五次免疫后采集、制备小鼠血清并进行间接ELISA检测,结果血清中效价可达1:256000。通过单克隆抗体技术,在免疫程序结束后取血清效价高的小鼠脾脏细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞进融合,经过三次亚克隆,筛选出两株杂交瘤细胞株分别命名为3B6、7G6。通过进一步筛选后将7G6单克隆细胞株注入小鼠腹腔,利用体内诱生法共制得腹水16mL,通过BCA法测定化前腹水的蛋白浓度为24.32 mg/mL,纯化后的腹水蛋白浓度为0.72 mg/mL,通过SDS-PAGE检测腹水纯化效果,结果表明腹水纯化效果良好。药物交叉试验结果显示,该AA单克隆抗体恩诺沙星、头孢氨苄、四环素、环丙沙星、BSA和OVA无明显的交叉反应,与安乃近交叉反应率为86.3%,与安乃近代谢产物4-甲氨基安替比林的交叉反应率为79.1%。3.ELISA检测方法的建立优化ELISA检测方法中的各项条件,确定2%明胶溶液为最佳封闭液,抗原抗体最佳工作浓度分别为1:3000和1:16000。ELISA标准抑制曲线线性方程为y=0.2894x-0.1085,相关系数R2=0.995,AA药品浓度在10～5000 ng/mL时线性关系良好,经过相关数据的计算得出:药物的 IC50为 120.79 ng/mL,LOD 为 7.1 ng/mL,LOQ 为 51.76 ng/mL。4.猪肉中AA添加回收试验本试验设置猪肉样品并通过相关步骤对猪肉样品进行前处理,样品溶液稀释16倍时可以排除样品基质的干扰。通过竞争抑制曲线的绘制可以看出药物浓度在20～2000 ng/mL时线性关系良好,线性回归方程为y=0.3489x-0.2311,相关系数R2=0.9907,药物半数抑制浓度 IC50 为 124.58 ng/mL,LOD 为 9.52 ng/mL,LOQ 为 22.68 ng/mL。设置三个药品浓度梯度分别为50 ng/mL、400 ng/mL和800 ng/mL进行添加回收试验,最后计算出猪肉样品中4-氨基安替比林的添加回收率在87.70%～101.57%。
【图文】：

路线图,人工抗原,路线

图２－１戊二醛法制备人工抗原路线逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋ｓｃｈｅｍｅ邋ｏｆ邋ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ邋ａｎｔｉｇｅｎ邋ｂｙ邋ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ逡逑１．５．３包被原的合成逡逑包被原的合成同１．５．２介绍的方法，将４－氨基安替比林与大分子载体蛋白ＯＶＡ进行偶逡逑联，在最后一步加入过量的甘氨酸以封闭未反应的醛基。逡逑１．６人工抗原的分析逡逑１．６．１人工抗原蛋白浓度的测定逡逑本试验采用ＢＣＡ法测定完全抗原ＡＡ－ＢＳＡ、ＡＡ－ＯＶＡ的蛋白浓度，方法如表２－１所示，逡逑具体实验步骤如下：逡逑（１）按照试剂盒说明要求将蛋白溶液配制成试验所需的标准蛋白溶液（０．５邋ｍｇ／ｍＬ），逡逑并使用标准蛋白溶液吸取０、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００邋ｈＬ加入到９６孔板中。逡逑（２）各孔加入ＰＢＳ溶液，每孔总体积为１００邋ｎＬ，使用移液器缓慢吹打每孔使各孔液逡逑体混合均匀。从各孔吸取２０邋ｈＬ溶液分别加入到三个空白孔中。逡逑（３）将合成的人工抗原溶液稀释成蛋白浓度为０？０．５邋ｍｇ／ｍＬ的区间内并加入每孔２０逡逑

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２结果逡逑２．１人工抗原蛋白浓度的测定结果逡逑根据试验测得的数据绘制的标准曲线如图２－２所示，线性方程为ｙ＝０．９５５１Ｘ－０．１１１，相逡逑关系数Ｒ２为０．９９６３，将相关数据代入公式计算得出，ＡＡ－ＢＳＡ蛋白浓度为５．７３邋ｍｇ／ｍＬ，逡逑ＡＡ－ＯＶＡ邋蛋白浓度为邋６．６１邋ｍｇ／ｍＬ。逡逑０．６邋ｒ逡逑０．５邋－逦＞逡逑＃４邋－逦ＪＴ逡逑Ｉ５邋０．邋３邋－逡逑]邋０．２邋－逦ｙ邋＝邋0．邋９５５１Ｘ邋－邋０．邋Ｉｌｌ逡逑５邋0．邋１邋－逦ｙｒ逦Ｒ２邋＝邋０．邋９９６３逡逑０邋逦１逦■逦１逦１逡逑０．０逦０．２逦０．４逦０．６逦０．８逡逑ｏｄ邋值／Ａ逡逑图２－２人工抗原蛋白标准曲线逡逑Ｆｉｇ．邋２－２Ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｓｔａｎｄａｒｄ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆ邋ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ邋ａｎｔｉｇｅｎ逡逑
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S859.84

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