我国猪圆环病毒3型和细小病毒1-7型感染的回顾性研究

发布时间：2020-04-06 15:49

【摘要】：猪病毒性传染病的频繁发生严重制约着我国养猪业快速、健康发展。当前,我国面临着旧病未除、新病又发的局面。因此病毒溯源在猪病毒性传染病的防控中起着举足轻重的作用。以往开展的猪病毒性传染病流行病学调查多依赖传统的技术方法,存在着检测病原单一、获得数据有限的问题。随着新技术的不断出现,病毒宏基因组学(Viral Metagenomics)为大规模检测和发现宿主体内存在的已知或未知的病毒提供了强有力的工具,目前已广泛应用于病毒性传染病流行病学调查研究中。我国曾于20世纪90年代开展过全国性大规模的猪病毒性传染病流行病学调查,采集了大量临床发病猪的组织样品,但受限于当时分子生物学检测技术的制约,所采集的临床发病猪携带病毒的本底情况并未充分得知,对于当前新发现的病毒,是否在当时就已经存在,对于长期流行的病毒,现流行毒株与二十年前流行毒株是否存在差异,其遗传进化规律如何,这些数据我们知之甚少,亟需开展相关研究。本研究对1990-1999年的100份临床发病猪的组织样品进行了病毒宏基因组学分析,结果显示共有16646条reads注释到了病毒序列,分属于14个病毒科和未分类病毒,其中4个病毒科为噬菌体,其余11个科为哺乳动物病毒科,主要包括圆环病毒科(Circoviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、指环病毒科(Anelloviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)和动脉炎病毒科(Arteriviridae)等。其中圆环病毒科中病毒reads数量最多,细小病毒科中病毒reads种类最为丰富。猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)是一种与猪皮炎肾病综合征、繁殖功能障碍、呼吸系统疾病和多系统炎症有关的病毒,首次于2015年在美国被发现,随后多个国家报道存在该病毒感染,我国PCV3感染的报道最早见于2015年,然而该病毒在此之前的感染与流行情况并不清楚。本研究对我国29个省、市、自治区的307份(1990-1999年:200份;2011-2017年:107份)临床组织样品进行了PCV3的特异性PCR检测,检测结果显示:阳性率为7.8%(24/307),阳性样品分布在8个省和1个自治区,最早出现在1996年。核苷酸序列比对分析结果显示,本研究获得的PCV3毒株与我国和国际现有的参考毒株在ORF2和全基因组水平上核苷酸同源性分别为96.6% 99.7%和97.1% 99.4%,该结果表明PCV3在过去20年中具有较高的遗传稳定性。猪细小病毒(porcine parvoviruses,PPV)是细小病毒科中能够引起猪繁殖功能障碍、消化和呼吸系统疾病的病毒的统称,包括经典的猪细小病毒1型(PPV1),以及近几年国内外陆续发现的猪细小病毒2-7型(PPV2-7)等新型细小病毒。结合宏基因组结果,本研究对我国30个省、市、自治区的437份(1990-1999:200份;2011-2017:237份)临床组织样品进行了PPV1-7的特异性PCR检测,检测结果显示:58.1%(254/437)的样品至少存在1种细小病毒感染,样品检测阳性率从高到低依次为PPV6(31.1%)、PPV2(28.4%)、PPV3(22.2%)、PPV7(13.5%)、PPV4(11.4%)、PPV5(5.9%)和PPV1(5.0%),PPV1-7阳性样品最早出现的年份分别为1998、1990、1993、1994、1999、1993和1997年。遗传进化分析结果显示:PPV2的ORF2基因核苷酸同源性为93.7%-100%,与我国和国际现有的参考毒株核苷酸同源性为92.8%-99.2%,可划分为2a-2h共8个基因型,1990-1999年我国流行的毒株主要为2a,2011年以后2a-2d和2g-2h都有流行,重组分析表明,26个重组毒株中有21个属于2c-2e,分别以2b、2g和2h毒株为重组亲本;获得的PPV3毒株与现有的参考毒株在ORF1和ORF2基因水平上核苷酸同源性分别为95.5%-99.5%、96.1%-99.4%;PPV4与现有的参考毒株在ORF1、ORF2和ORF3基因水平核苷酸同源性分别为96.2%-99.9%、98.4%-99.8%、96.0%-100%;PPV5毒株在ORF1和ORF2基因水平上核苷酸同源性分别为97.4%-99.9%、98.8%-99.8%,这表明PPV3-5在过去的20年具有较高的遗传稳定性;获得的PPV6毒株与现有的参考毒株在ORF1和ORF2基因核苷酸同源性分别为98.4%-99.8%、94.8%-99.8%,可分为2个基因型,分别为6a、6b,1990-1999年我国主要流行6b,2014年后两个基因型都有流行;获得的PPV7毒株与现有的参考毒株在ORF1和ORF2基因水平上核苷酸同源性分别为92.9%-99.2%、84.0%-98.9%,可划分为7a-7f共6个基因型,1990-1999年我国流行的毒株主要以7a为主,其次是7d和7e,2011年以后,6个亚型在我国均有流行,其中广东和广西主要以7b为主,且7b基因型的毒株为广东和广西所特有,7f只有一个毒株,来自于我国广西,此外,PPV7存在基因缺失和基因重组现象。本研究采用病毒宏基因组方法对我国20世纪90年代发病猪群携带病毒的情况进行了摸底研究,并对其携带的PCV3、PPV1-7进行了分子流行病学调查,其研究发现极大的丰富了我国PCV3和PPV1-7感染的流行病学数据,为该病的监测预警、诊断与预防奠定了科学基础。
【图文】：

地理分布图,样品,临床样品,猪场

东北农业大学农学硕士学位论文2 材料与方法2.1 实验材料2.1.1 临床样品本研究所用的 437 份临床发病猪的组织样品由实验室收集并保存，样品类型包括脾脏、肾脏、淋巴结和肺脏等，每一份样品都来自于不同的猪场，分别于 1990-1999 年和 2011-2017年采集自我国 21 个省、5 个自治区和 4 个直辖市，样品详细信息见图 2-1 和表 2-1。从地理分布看，广东省的样品数量最多，其次是黑龙江、湖南和广西，而宁夏、四川、浙江和重庆仅有 1 份。从时间分布看，样品主要采集自 1999、2017 和 1998 年，其次是 2015、2011、2014、1996 年，而 1990、1994 和 2004 年仅有 1 份。样品在使用前后均保存于-80℃冰箱。

分析统计,病毒,20世纪90年代,样品

3 结果3.1 宏基因组测序结果100 份组织样品的宏基因组测序结果显示，共有 16646 条 reads 注释到了病毒序列，分属于 14 个病毒科和未分类病毒，其中 4 个病毒科为噬菌体：长尾噬菌体（Siphoviridae）、短尾噬菌体（Podoviridae）、肌尾噬菌体（Myoviridae）和微病毒科（Microviridae），其余均为哺乳动物病毒。如图 3-2 所示，，注释到 reads 数量最多的是圆环病毒科，共有 13651 条，占总 reads数量的 82.0%，其次是黄病毒科，其 reads 数目为 1287 条，占 reads 数量的 7.7%。在哺乳动物病毒中，圆环病毒科的病毒主要为圆环病毒属的 PCV2，reads 数量为 9879 条；细小病毒科的 reads 中有 161 条 reads 为博卡病毒，81 条 reads 为 PPV1，9 条 reads 为 PPV2，20 条 reads为 PPV6，16 条 reads 为 PPV7。黄病毒科的病毒主要为瘟病毒属的猪瘟病毒；小核糖核酸病毒科中的病毒主要为肠道病毒和萨佩罗病毒；疱疹病毒科（Herpesviridae）的病毒为猪巨细胞病毒；逆转录病毒科（Retroviridae）的病毒为猪内源性逆转录病毒；动脉炎病毒科（Arteriviridae）的病毒为猪蓝耳病病毒；冠状病毒科（Coronaviridae）中病毒为猪呼肠孤病毒；指环病毒科的病毒为 Torque teno sus virus。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.28

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