水貂源新城疫病毒的分离鉴定及致病性研究

发布时间：2020-04-07 03:51

【摘要】：新城疫病毒属于单分子负链RNA目副黏病毒科副黏病毒亚科禽腮腺炎病毒或禽副黏病毒属成员,可引起具有致命性和高度传染性的新城疫疾病。自然感染的禽类动物可导致其呼吸系统、生殖系统以及神经系统的损伤。目前,新城疫病毒的易感动物已呈现多样化,不再局限于禽类动物,水貂也受到该病毒的感染。新城疫病毒对水貂养殖业造成巨大的经济利益损失,成为危害我国水貂养殖业的重要疫病之一。虽然已有不少学者对禽类动物新城疫病毒进行了研究,但关于水貂源新城疫病毒的生物学特性及流行病学等方面,仍有很多问题亟待解决。鉴于目前新城疫病毒的检测方法具有很大的局限性,且主要针对禽类动物,因此急需建立一种简捷高效的检测方法对水貂进行全面有效的诊断和监控,以加强水貂养殖业的疫病防控,对水貂养殖业的健康发展具有重要的作用。本研究以黑龙江省某水貂养殖场的自然发病水貂为研究对象,通过临床症状观察、病毒分离鉴定、动物回归试验及分子生物学检测等方法,证明水貂的发病病原是水貂源新城疫病毒,且为强毒株毒力。这是我国首次从水貂体内成功分离得到的一株水貂源新城疫病毒分离株,命名为mNDV-01-HLJ毒株。随后,成功对mNDV-01-HLJ毒株进行全基因组克隆测序,获得15192 bp的全基因组序列,并对其序列和编码蛋白进行生物信息学分析以及构建分子遗传进化树,结果表明分离病毒属于Class Ⅱ基因Ⅶ型毒株。HN蛋白是新城疫病毒的主要囊膜糖蛋白,HN基因的研究会对新城疫病毒的生物学特性及诊断预防等方面研究具有重要指导作用。本研究选取HN蛋白胞外区抗原性较好的区域设计引物,成功扩增出长为1578 bp的目的基因,克隆至表达载体pGEX-6P-1中,构建重组表达载体pGEX-mNDV-HN,将阳性重组质粒转化到大肠杆菌感受态BL21中,通过IPTG诱导表达,获得可溶性表达的目的蛋白83 kDa,且具有良好的免疫原性。最后,以该重组蛋白为诊断抗原建立水貂源新城疫病毒间接ELISA检测方法,通过矩阵法优化确定其最佳条件,其中抗原包被浓度为200 ng/孔、血清稀释度为1:80、封闭液底物为5%脱脂乳、二抗工作浓度为1:5000、底物作用时间为20 min。通过验证实验结果表明,建立的间接ELISA检测方法具有更高的特异性和敏感性。综上所述,本研究成功从水貂体内分离出一株新城疫病毒mNDV-01-HLJ毒株,通过克隆测序获得了其全基因组序列并进行生物信息学分析;并以截短表达的pGEX-mNDV-HN蛋白为抗原,建立了水貂源新城疫血清内抗体的间接ELISA检测方法。本研究将有助于分析中国水貂源新城疫病毒的分子流行情况,了解水貂源新城疫病毒的遗传规律,为水貂源新城疫病毒疫苗株的筛选及疾病的诊断奠定了基础。
【图文】：

新城疫病毒,结构模式,病毒颗粒

）被转录成信使ＲＮＡ，其将被翻译成不同的病毒蛋白质或ｓｓＲＮＡ邋（邋＋邋），将用作合成逡逑ｓｓＲＮＡ邋（－）的反应模板。其后，病毒蛋白和基因组ＲＮＰ将被装配在宿主细胞膜的细胞逡逑质内部小叶上，并通过萌芽释放病毒颗粒新的子代，，如图１－２所示。ＨＮ蛋白的神经氨逡逑酸酶可以去除新生病毒颗粒中的唾液酸残基，从而防止它们结合并加快病毒在感染组织逡逑内的扩散。逡逑－２邋－逡逑

新城疫病毒,基因组结构,顺式作用元件,基因组

－ＡＵＵＣＵＵＵＵＵＵ－５，），逡逑且每个基因组之间被保守的序列分开（３’－ＧＡＡ－５’），这些顺式作用元件控制病毒的复逡逑制、壳体化和病毒包装（图１－３）邋［１８］。逡逑－３邋－逡逑
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65

【参考文献】