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重组人溶菌酶对鸡肠道粘膜免疫的影响

发布时间:2020-04-07 04:20
【摘要】:沙门氏菌不仅能引起家禽发病死亡造成严重的经济损失,而且被沙门氏菌污染的家禽产品会严重危害人类健康。研究表明,外源添加人溶菌酶能显著抑制鸡沙门氏菌病的发生。本文利用构建好的重组人溶菌酶转基因鸡模型,与非转基因鸡比较,测定鸡肠炎沙门氏菌攻毒后鸡盲肠和脾脏组织的载菌量、血清IgG水平、肠粘膜IgA分泌、盲肠中细胞因子和鸡体重的变化,以及对心脏、肝脏、脾脏和盲肠所造成的炎性损伤,从组织和分子水平上系统研究重组人溶菌酶对鸡肠道粘膜免疫的影响,为鸡抗病育种提供重要的理论依据。首先,我们对构建好的高效表达重组人溶菌酶转基因农大三号小型蛋鸡进行扩繁,通过PCR双引物鉴定的方法优化了外源基因检测手段,并采用Southern blot方法进一步确定了外源基因的整合,成功鉴定出194只携带人溶菌酶基因的转基因鸡。接着,利用ELISA方法测定了转基因鸡血清中人溶菌酶的平均浓度为29.90±6.50μg/mL;另外,通过抑菌圈法和稀释平板扩增法检测了转基因鸡蛋清中人溶菌酶的抑菌活性,发现转基因鸡蛋清溶菌酶对溶壁微球菌的抗菌活性显著高于非转基因鸡(P0.05);对转基因和非转基因鸡粪便进行细菌分离培养,检测其中五种细菌的数量(乳酸杆菌、沙门氏菌、双歧杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌),发现转基因鸡肠道双歧杆菌的数量显著高于非转基因鸡(P0.05);此外,转基因鸡的六周胫长、六周体重和十八周体重较非转基因鸡均显著增加。随后,为了验证重组人溶菌酶转基因鸡对沙门氏菌病的抑制作用,我们选取来自同一家系的10只G2代转基因公鸡与G2代非转基因母鸡交配,收集300枚受精蛋,孵化出232只G3代雏鸡。将232只G3代雏鸡随机分成两组:攻毒组和对照组,攻毒组于1日龄口服鸡肠炎沙门氏菌悬液1x108CFU/mL 0.2 mL/只,对照组口服等量无菌PBS,分别饲养于隔离仓中。在攻毒后1 d、3d、7 d和14 d时分别对感染雏鸡和未感染雏鸡进行屠宰采样,检测不同组的感染情况,同时进行生长性能、组织病理学和血清学指标的测定。结果表明:①不论是否感染肠炎沙门氏菌,转基因鸡体重均显著高于非转基因鸡;②在7 dpi和14 dpi时,相较于非转基因鸡,转基因鸡表现出更轻微的组织病变;③在7 dpi和14 dpi时,转基因鸡盲肠中肠炎沙门氏菌的载菌量显著低于非转基因鸡(P0.05),尽管脾脏中肠炎沙门氏菌的载菌量较高,但与对照组相比未达到显著水平(P0.05);④在14 dpi时,感染肠炎沙门氏菌的转基因鸡血清中IgG水平显著高于未感染的转基因鸡(P0.05);另外,在7 dpi和14 dpi时,感染肠炎沙门氏菌转基因鸡肠黏膜分泌的IgA含量达到最大值,并显著高于其它三组(P0.05);感染肠炎沙门氏菌后,转基因鸡IFNI的表达量显著低于非转基因鸡(P0.05)。综上所述,本论文通过重组人溶菌酶转基因鸡模型研究发现,重组人溶菌酶对鸡肠道菌群具有一定的调节作用,可以促进肠道双歧杆菌的增长及出生后增重。另外重组人溶菌酶可通过改善鸡肠道炎性损伤并提前诱发体液免疫,增强鸡自身对沙门氏菌病的抑制作用。
【图文】:

氨基酸序列,人溶菌酶,溶菌酶,氨基酸序列


制大肠杆菌、沙门氏菌等引起的仔猪腹泻,降低仔猪腹泻率,改善仔猪的生存状况,提高养猪效逡逑益。逡逑三、抗山羊、奶牛乳房炎:随着生物反应器技术的不断成熟,人们己经能成功制备乳腺中表逡逑达重组人溶菌酶的转基因山羊和转基因奶牛,高效表达的重组人溶菌酶羊奶和牛奶能显著杀伤大逡逑肠杆菌和金黄色葡萄杆菌,有效抑制山羊和奶牛乳房炎的发生[92]。逡逑四、临床应用药物:利用溶菌酶己经研制出了大量的临床药物,如溶菌酶含片、溶菌酶肠溶逡逑片等,目前在市面上流传甚广,可明显改善皮肤、口腔、上呼吸道等疾病症状,对人类健康带来逡逑积极影响[93]。逡逑五、食品工业上的应用:溶菌酶具有广谱抗菌特性,目前己被广泛用于青酒、料酒、饮料、逡逑肉质品、蛋糕及水产品食物防腐剂中[94 ̄]。溶菌酶的耐热性刺激了奶制品超高温瞬间杀菌技术的逡逑成熟发展[100]。重组人溶菌酶还可以用于乳酪加工,显著缩短牛奶凝乳时间[1°1]。逡逑1.3.3人溶菌酶概述逡逑人溶菌酶(hLZ)是一类C型溶菌酶,分子量为14.6邋KD,由130个氨基酸组成,含有4个二逡逑硫键[102_105]。不同种类溶菌酶一级结构的氨基酸组成和排列顺序差异巨大,但高级结构非常类似,逡逑体现溶菌酶空间结构进化保守性[106]。近年来,随着人们对人溶菌酶功能的不断挖掘,发现人溶菌逡逑酶表现一定的抗病毒、增强免疫力以及抗肿瘤功效,加深了人溶菌酶在临床研宄中的应用价值。逡逑

示意图,固定膜,示意图,杂交管


图2-1邋Southern邋Blot转膜示意图逡逑Fig.2-1邋Schematic邋diagram邋about邋Transmembrane邋in邋Southern邋blot逡逑固定膜:逡逑1)小心移去上方的方巾纸、滤纸,沿胶孔将膜和胶的上方一起剪掉,并把膜和胶的右上角逡逑剪掉以作标记,胶放入EB溶液染色,,观察转膜效果;逡逑2)将膜放入装有2XSSC的保鲜盒中,漂洗10邋min,将膜取出平铺于2XSSC预先浸润的逡逑滤纸表面(膜的正面朝上),放入紫外交联仪中,紫外交联150邋s。逡逑(3)杂交逡逑1)预杂交:将杂交管中装满去离子水,赶走气泡,将膜放入杂交管中(膜的正面向内),逡逑使其贴壁无气泡,慢慢倒出去离子水,加入15邋mL邋DIG邋Hyb邋easy邋solution邋45邋°C杂交管中杂交lh逡逑左右;逡逑2)变性探针:取20nL(60ng4iL)DIG标记好的探针(每毫升杂交液中加入2^LPCR标记逡逑好的探针),加100邋HLddH20,邋100邋°C煮沸10邋min,冰上骤冷3邋min;逡逑3)杂交:BD管中45邋°C预热10邋mL杂交液,将变性完全的探针全部加入并混勾,倒出杂逡逑,,45邋°C。逡逑
【学位授予单位】:中国农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S831

【参考文献】

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本文编号:2617440

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