适配体干扰致仔猪腹泻ETEC K88与仔猪肠道上皮细胞IPEC-J2黏附作用研究

发布时间：2020-04-07 12:11

【摘要】：断奶应激可导致仔猪易受病原菌感染,从而引起腹泻甚至死亡。产肠毒性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)主要包括K88、K99、987P以及F4,它们是引起仔猪断奶后腹泻的典型菌株。因此,预防和治疗ETEC感染的方法倍受大众关注。适配体主要是通过指数富集系统进化技术筛选出来的一段对靶标具有高亲和力和特异性的ssDNA或RNA。本文以猪肠上皮细胞系IPEC-J2为体外模型,发现K88-Apt 37(ETEC K88的菌毛适配体)和K88-Apt A04(ETEC K88的菌体适配体)能有效地减少病原菌ETEC K88对肠上皮细胞的黏附,从而减少随后的炎症反应。我们的研究工作主要包括以下几点:(1)将仔猪肠道上皮细胞系IPEC-J2用作体外模型以评估适配体对ETEC K88的黏附和细胞毒性作用的影响,确定了ETEC K88-IPEC-J2互作模型的基础浓度(10 MOI)以及作用时间。在此作用条件下,评估适配体在黏附抑制,黏附竞争,黏附置换三种作用模式下对此互作模型的影响。结果显示,适配体在三种互作模型下都能减少细菌对细胞的黏附。(2)为更好地观察适配体对ETEC K88黏附细胞的作用效果,我们构建了荧光质粒并导入ETEC K88中使细菌ETEC K88成功表达EGFP荧光蛋白。流式细胞仪分析以及荧光显微镜观察以进一步探究适配体对三种互作模型的作用效果,发现K88-Apt 37与靶标菌的亲和力较高,K88-Apt A04造成的细胞毒性较小,低浓度的K88-Apt 37或高浓度的K88-Apt A04用作抑制剂来减少肠道上皮细胞感染的效果更好。除此之外,互作模型中适配体对减少细菌造成的细胞凋亡的效果基本呈现黏附抑制黏附竞争黏附置换的趋势,提示将适配体作为预防性药物在病原菌感染之前使用可能效果更好。(3)使用荧光定量PCR和ELISA试剂盒分析了两种适配体分别对ETEC K88-IPEC-J2互作模型中的IPEC-J2细胞的主要炎症因子的mRNA和蛋白表达情况,探讨适配体帮助IPEC-J2细胞免受ETEC K88攻击损伤的分子机制。结果表明,适配体的存在能下调ETEC K88引起的IPEC-J2细胞中TNF-α的表达,也能下调由ETEC K88引起的细胞中模式识别受体(PRR)和促炎细胞因子的mRNA的表达,说明适配体能降低致病菌攻击引起的炎症因子的分泌。总之,适配体K88-Apt 37和K88-Apt A04能通过与细菌相互作用从而减少细菌对肠上皮细胞的黏附,进而减少细菌造成的细胞毒性与炎症反应,保护肠上皮细胞免受ETEC K88攻击,对大肠杆菌ETEC K88引起的仔猪腹泻的防治具有重要作用,也为其他致病微生物所引起的腹泻的治疗提供了新思路。
【图文】：

菌毛,鞭毛,细丝,显微照片

附于宿主的小肠上皮细胞故而又称黏附因子(Adhesion Factor)或定居因子(Colonizing Factor)。ETEC F4菌毛在电子显微镜下呈纤细的绒毛丝状，长约0.5~3μm，，直径为2~5 nm（图1-1），以多聚蛋白的形式遍布在菌体的表面[11]。ETEC进入宿主细胞后，首先黏附于小肠上皮细胞以避免由于肠道的蠕动和肠液的冲刷而将其排出体外，接着在肠内定居并繁殖，进而诱发机体并发感染。菌毛的黏附

机制,肠毒素,靶细胞,亚基

使A亚基能进入靶细胞以产生毒素活性[14]（图1-2）。图 1-2 产肠毒素大肠杆菌的热敏肠毒素 LT 导致动物腹泻的作用机制[15]Fig.1-2 Classic mechanisms of action of heat-labile enterotoxin (LT) produced by ETEC（2）热稳定性肠毒素(ST)
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.28

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