H9N2亚型禽流感病毒在疫苗抗体选择压的鸡体内连续传代后的抗原变异和基因分析

发布时间：2020-04-07 15:13

【摘要】：20世纪60年代在威斯康辛州的火鸡鸡体内分离出H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)以来,该病毒已经在世界范围内传播。为控制H9N2亚型禽流感病毒的传播,中国内地已广泛实施H9N2亚型禽流感病毒疫苗接种计划。虽然这项免疫计划有效地减少了 H9N2亚型禽流感病毒对鸡群造成的经济损失,但它并未阻止H9N2亚型禽流感病毒在中国大部分地区的传播。为了研究H9N2亚型禽流感病毒的演化,早前本实验室已经在鸡胚中对H9N2亚型禽流感病毒进行连续传代,另外也对混合的H9N2亚型禽流感病毒在SPF鸡体内连续传代进行了相关研究,观察到传代病毒在抗原性和致病性等方面的变化。为了减少混合病毒对研究结果的干扰,探究病毒在每只鸡个体内传代后的变异情况,在本试验中我们选择在疫苗抗体选择压下的鸡体中进行一对一单传的传代模式,即以A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2,F/98)禽流感病毒为研究对象,将F/98株病毒在有和没有同源疫苗抗体选择压力下的SPF鸡体内连续一对一传代,通过HI试验和分子生物学等技术分析所得的传代病毒的抗原漂移、遗传进化及其病毒毒力的变化情况,为禽流感的疫苗防治工作提供新的理论基础。1.F/98株分别在有和没有疫苗抗体选择压下的鸡体内的连续传代及其抗原性和鸡胚感染力分析将6只21日龄的SPF鸡分为有疫苗抗体选择压传代组(V)和无疫苗抗体选择压传代组(N)两组,每组各三只。V组建立三个独立传代系列V1、V2和V3,用F/98株油乳剂灭活疫苗分别经肌肉和皮下注射免疫,免疫后待血清中的抗体滴度HI值为24时,进行感染实验;N组建立三个独立传代系列N1、N2和N3,直接进行感染实验。所有V组和N组的第一代传代系列均用同一批次收集的F/98株的病毒尿囊液,将病毒按照106 EID50/0.2mL的剂量分别对SPF鸡进行感染,感染途径为滴鼻、点眼和灌喉。感染后3d分别取各个传代系列实验鸡的肺和气管,分别制备四抗PBS的组织研磨液,并置于-70℃冻存备用,此为第一代有和没有疫苗抗体选择压下传代的组织均浆液。接着取6只21日龄的SPF鸡,按上述同样方法分组,以此方法类推,共进行到第9代次的传代系列。取第5代次和第9代次的肺和气管的组织匀浆液分别接种10日龄鸡胚,分离获得在有和没有疫苗抗体选择压的鸡中传代的病毒尿囊液;将分离收集的病毒尿囊液与母本病毒F/98株的阳性多抗血清进行HI实验。结果显示,与母本病毒F/98株的HI效价相比,有疫苗抗体选择压下第5代次肺组织分离的传代病毒(简称V5L)、无疫苗抗体选择压下第5代次肺组织分离的传代病毒(简称N5L)、有疫苗抗体选择压下第5代次气管分离的传代病毒(简称V5T)和无疫苗抗体选择压下第5代次气管分离的传代病毒(简称N5T)的HI均没有明显差异;然而,有疫苗抗体选择压下第9代次肺组织分离的传代病毒(简称V9L)和无疫苗抗体选择压下第9代次肺组织分离的传代病毒(简称N9L)的HI效价下降了 8倍。同时,有疫苗抗体选择压下第9代次气管分离的传代病毒(简称V9T)和无疫苗抗体选择压下第9代次气管分离的传代病毒(简称N9T)的HI效价下降了 16倍。这些结果表明,经过5个代次的传代后,相比母本病毒F/98株,传代病毒的抗原性基本没有变异;而经过9个代次的传代后,与母本病毒F/98株相比,传代病毒抗原性均发生了明显的变异。第9代次的传代病毒在有和没有疫苗抗体选择压下的适应性不仅包括抗原性变化,而且还表现出对鸡胚感染力和致死力的变化。V9L和V9T病毒的EID50是母本病毒F/98株的1.77倍,二者无明显差异;而N9L和N9T病毒的EID50分别是母本病毒F/98株的25.4倍和17.7倍,传代病毒的鸡胚感染力显著提高。此外,与F/98株相比,V9L和V9T病毒丧失了致死鸡胚的能力,而N9L和N9T病毒的ELD50仅提高了 0.77倍,与母本病毒无明显差异。综上所述,没有疫苗抗体选择压下的传代病毒对鸡胚的感染力相比母本病毒有了显著提高,而有疫苗抗体选择压下的传代病毒对鸡胚的感染力相比母本病毒变化不大,但丧失了致死鸡胚的能力。2.F/98株病毒的第9代次传代病毒的基因分析将第9代次的优势传代病毒与亲本病毒F/98株相比,除了病毒的抗原性发生改变,各基因片段的部分氨基酸也发生了变化。与母本病毒相比,V9L病毒共计发生了 13个氨基酸突变,其中 PB2 基因 5 个(T296K,A322E,R327K,H366Q,Y369S)、PB1 基因 2个(T251V,A669G)、HA 基因 2 个(K131R,A198V)、NP 基因 1 个(A100R)、NA基因1个(C385T)、M基因2个(P154A,A246Q);V9T病毒共计发生了 11个氨基酸突变,其中 PB2 基因 4 个(A322E,R327K,H366Q,Y369S)、PA 基因 1 个(S148H)、HA 基因 2 个(A198V,Q234L)、NP 基因 1 个(G45T)、NA 基因 1 个(C385T)、M基因2个(P154A,A246Q);N9L病毒共计发生了 20个氨基酸突变,其中PB2基因6个(T138A,T296K,I298Q,R327K,Y369S,E526R)、PB1 基因 1 个(T348A)、PA基因 4 个(S148H,L336M,K544M,S640K)、HA 基因 2 个(N167G,N285S)、NP基因 3 个(G52A,D65L,L187G)、M 基因 2 个(H23I,T331A)、NS 基因 2 个(S81L,H85S);N9T病毒共计发生了 18个氨基酸突变,其中PB2基因5个(T296K,I298Q,R327K,Y369S,E526R)、PB1 基因 1 个(T348A)、PA 基因 2 个(S148H,L336M)、HA 基因 3 个(A198V,Q234L,N285S)、NP 基因 4 个(G52A,S65L,L187G,G419V)、M基因1个(H23I)、NS基因2个(S81L,H85S);此外,V9L和V9T病毒的NA蛋白在67-76位缺失10个氨基酸(A67-76)。这些结果显示,抗体选择压使病毒的NA蛋白发生67-76位氨基酸缺失;抗体选择压下的传代病毒氨基酸突变数量明显少于没有抗体选择压下的传代病毒氨基酸突变数量;肺组织分离到的传代病毒氨基酸突变数量略多于相同传代条件下气管中分离到的传代病毒氨基酸突变数量。综上所述,在有和没有疫苗抗体选择压下连续传代9代次,H9N2亚型禽流感病毒F/98株的抗原性都发生了变异;抗体选择压使F/98株失去致死鸡胚能力,NA蛋白发生67-76位氨基酸缺失,使F/98株基因组突变数显著少于无抗体选择压下传代的病毒。这些结果表明,疫苗抗体选择压力对H9N2亚型禽流感病毒的进化及其一些生物学特性的变化具有重要作用。
【图文】：

■■■逦■■Ｉ逡逑１４图２－１邋ＨＡ基因ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物逡逑图２－２ＮＡ基因ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物逡逑Ｆｉｇ．２－１．邋ＲＴ－邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ＨＡ邋ｇｅｎｅ逡逑Ｍ：ＤＬ５０００ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；逦Ｆｉｇ．２－２．邋ＲＴ－ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ＮＡ逡逑１４邋：Ｖ９Ｌ，Ｖ９Ｔ，Ｎ９Ｌ，Ｎ９Ｔ，ＨＡ邋基因邋１７４２ｂｐ逦ｇｅｎｅ邋Ｍ：邋ＤＬ邋５０００邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；逡逑１＞４：Ｖ９Ｌ，Ｖ９Ｔ，Ｎ９Ｌ，Ｎ９Ｔ，ＮＡ邋基因邋１３１４ｂｐ逡逑Ｍｌ邋２３４５６７８逦Ｍ邋＇逦２邋Ｊ邋４逡逑■邋ｍ逡逑１３１２００ｂｐ逦，３００ｂＰ逡逑图２－３邋ＰＡ基因ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物逦图２－４邋ＰＢ２－１基因ＲＴ－ＰＣＲ扩增产Ｆｉｇ．２－３．邋ＲＴ－邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ＰＡ邋ｇｅｎｅ逦Ｆｉｇ．２－４．邋ＲＴ－邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ＰＢＭ：邋ＤＬ邋２０００邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；逦Ｍ：邋ＤＬ邋２０００邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；逡逑１＊４邋：Ｖ９Ｌ，Ｖ９Ｔ，Ｎ９Ｌ，Ｎ９Ｔ，ＰＡ－１邋基因邋１２００ｂｐ邋；逦１－４邋：Ｖ９Ｌ，Ｖ９Ｔ，Ｎ９Ｌ，Ｎ９Ｔ，ＰＢ２－１邋基因邋１５－８：Ｖ９Ｌ，Ｖ９Ｔ，Ｎ９Ｌ，Ｎ９Ｔ，ＰＡ－２邋基因邋１３００ｂｐ逡逑

邋２逦３逦４逡逑■■■逦■■Ｉ逡逑１４图２－１邋ＨＡ基因ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物逡逑图２－２ＮＡ基因ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物逡逑Ｆｉｇ．２－１．邋ＲＴ－邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ＨＡ邋ｇｅｎｅ逡逑Ｍ：ＤＬ５０００ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；逦Ｆｉｇ．２－２．邋ＲＴ－ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ＮＡ逡逑１４邋：Ｖ９Ｌ，Ｖ９Ｔ，Ｎ９Ｌ，Ｎ９Ｔ，ＨＡ邋基因邋１７４２ｂｐ逦ｇｅｎｅ邋Ｍ：邋ＤＬ邋５０００邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；逡逑１＞４：Ｖ９Ｌ，Ｖ９Ｔ，Ｎ９Ｌ，Ｎ９Ｔ，ＮＡ邋基因邋１３１４ｂｐ逡逑Ｍｌ邋２３４５６７８逦Ｍ邋＇逦２邋Ｊ邋４逡逑■邋ｍ逡逑１３１２００ｂｐ逦，３００ｂＰ逡逑图２－３邋ＰＡ基因ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物逦图２－４邋ＰＢ２－１基因ＲＴ－ＰＣＲ扩增产Ｆｉｇ．２－３．邋ＲＴ－邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ＰＡ邋ｇｅｎｅ逦Ｆｉｇ．２－４．邋ＲＴ－邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ＰＢＭ：邋ＤＬ邋２０００邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；逦Ｍ：邋ＤＬ邋２０００邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；逡逑１＊４邋：Ｖ９Ｌ，Ｖ９Ｔ，，Ｎ９Ｌ，Ｎ９Ｔ，ＰＡ－１邋基因邋１２００ｂｐ邋；逦１－４邋：Ｖ９Ｌ，Ｖ９Ｔ，Ｎ９Ｌ，Ｎ９Ｔ，ＰＢ２－１邋基因邋１５－８：Ｖ９Ｌ，Ｖ９Ｔ，Ｎ９Ｌ，Ｎ９Ｔ，ＰＡ－２邋基因邋１３００ｂｐ逡逑
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.65

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 李红丽;闫巍文;王红宝;郭雪丽;张晋强;王志宇;王毅;;新城疫与H9N2亚型禽流感嵌合型病毒样颗粒的构建与鉴定[J];黑龙江畜牧兽医;2018年17期

2 丛彦龙;钟颖;孙艺学;丁壮;;H9N2亚型禽流感病毒流行病学及其疫苗的研究进展[J];中国兽医学报;2017年02期

3 鲁健;田科雄;;H9N2禽流感病毒研究进展[J];实用预防医学;2011年02期

4 张静;陈立根;张宇;孙乾晋;李如意;白牧原;蔺文成;谢青梅;;1997～2015年我国不同地区H9N2亚型禽流感病毒流行情况研究[J];中国家禽;2016年20期

5 陈建新;张瑞华;徐明举;利凯;徐彤;;H9N2亚型猪流感病毒的分离、鉴定及其对小鼠的致病性研究[J];安徽农业科学;2011年21期

6 张正姬;;H9N2亚型禽流感病毒的研究现状[J];动物医学进展;2006年11期

7 王珂;张传美;杨海燕;韩先杰;乔健;;H9N2亚型禽流感病毒对豚鼠致病力的研究[J];黑龙江畜牧兽医;2015年01期

8 贾倩楠;赵丽丽;邓涛;曹萌萌;;重组H9N2禽流感病毒的构建及其在不同细胞中的复制特性[J];基础医学与临床;2015年04期

9 李照伟;刘朔;侯广宇;李金平;王素春;庄青叶;张笑春;费荣梅;陈继明;;我国长三角和珠三角地区活禽市场H9N2亚型禽流感流行病学调查[J];畜牧与兽医;2015年10期

10 刘坤洋;;H9N2亚型禽流感流行状况及防控[J];畜牧与饲料科学;2012年07期

相关会议论文 前10条

1 刘月焕;姜北宇;潘裕华;景小冬;郑世兰;魏甫青;;H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定[A];中国畜牧兽医学会禽病学会分会第十次学术研讨会论文集[C];2000年

2 李呈军;井波;余丹丹;邓国华;田国彬;李雁冰;于康震;陈化兰;;中国大陆H9N2亚型禽流感病毒遗传演化研究[A];中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集（下册）[C];2004年

3 薛慧俊;方炳虎;张在军;黄玉强;陈建新;;穿心莲内酯及其衍生物抗H9N2禽流感病毒的体内药效研究[A];纪念《元亨疗马集》付梓400周年中国畜牧兽医学会中兽医学分会2008年学术年会华东区第十八次中兽医科研协作与学术研讨会暨兽药发展论坛论文集[C];2008年

4 齐岩;袁润余;张贺楠;谢杰;单芬;胡月;李小康;陈晓春;赵丽荣;廖明;;H9N2亚型禽流感病毒广东分离株的全基因克隆及序列分析[A];中国畜牧兽医学会2008年学术年会暨第六届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集[C];2008年

5 罗玲;胡薛英;程国富;谷长勤;周全;李自力;赵雅心;周诗其;毕丁仁;;H9N2亚型禽流感病毒人工感染蛋鸡的组织病理学研究[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分第12次暨中国动物病理生理学专业委员会第11次学术讨论会论文集[C];2003年

6 薛瑞雪;包旦奇;侯天龙;刘焕奇;李泽君;刘芹防;;水貂源H9N2流感病毒分子特征与致病性研究[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第五次学术研讨会论文集[C];2016年

7 黄艳艳;徐栋;胡北侠;张秀美;路希山;;分离自中国北方的四株H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因的分子进化分析[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会成立大会暨第一次学术研讨会论文集[C];2008年

8 张继荣;姚青;;2007～2011年H9N2亚型禽流感病毒血凝素分子进化分析[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年

9 刘振勇;邓国华;李呈军;张立春;田国彬;何后军;于康震;陈化兰;;抗禽流感H9N2亚型血凝素特异性单克隆抗体的制备与分析[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第六次研讨会论文集[C];2005年

10 冉伟;陈瑞玲;邓颖琦;钟颖;丁壮;丛彦龙;;H9N2亚型鸡流感病毒吉林分离株全基因克隆与序列分析[A];中国畜牧兽医学会2014年学术年会论文集[C];2014年

相关重要报纸文章 前1条

1 中国农业大学 赵继勋;H5和H9N2 亚型禽流感的防控[N];河北科技报;2018年

相关博士学位论文 前10条

1 褚军;鹦鹉热衣原体感染加重鸡H9N2亚型禽流感发病的机制研究[D];中国农业大学;2017年

2 平继辉;H9N2亚型禽流感病毒抗原变异及感染哺乳动物分子机制的研究[D];南京农业大学;2008年

3 徐大伟;H9N2亚型禽流感病毒与鸭坦布苏病毒的生物学特性研究及疫苗的初步研制[D];内蒙古农业大学;2012年

4 刘旭东;H9N2重组病株药物分子动力学与代谢核心研究[D];大连理工大学;2012年

5 索朗斯珠;H9N2亚型禽流感病毒及新城疫病毒西藏分离株的生物学特性研究[D];华中农业大学;2011年

6 李建伟;欧亚大陆H9N2亚型禽流感病毒分子演化的研究[D];东北农业大学;2002年

7 张传美;H9N2亚型禽流感病毒感染水貂的研究[D];中国农业大学;2016年

8 张坤;豚鼠抗流感病毒相关因子研究及H9N2亚型禽流感病毒致病力分析[D];北京协和医学院;2013年

9 魏延迪;H9N2 亚型禽流感病毒抗原性变异及其冷适应疫苗交互免疫机制研究[D];中国农业大学;2016年

10 李曦;中国大陆H9N2亚型禽流感病毒遗传演化关系的研究[D];中国农业科学院;2002年

相关硕士学位论文 前10条

1 郑丽荣;H9N2亚型禽流感病毒在疫苗抗体选择压的鸡体内连续传代后的抗原变异和基因分析[D];扬州大学;2019年

2 卫盼莹;黄芩苷在体外抗H9N2亚型禽流感病毒的机理初探[D];北京农学院;2018年

3 马丽莉;H9N2亚型禽流感病毒诱导鸡体表达细菌粘附相关蛋白的筛选及其功能初步验证[D];山东农业大学;2018年

4 杨玲玲;鸭源H9N2亚型AIV分离鉴定与荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用[D];山东农业大学;2017年

5 王尧;烟曲霉菌感染雏鸡的先天性免疫应答及继发大肠杆菌、H9N2禽流感病毒感染的研究[D];山东农业大学;2017年

6 刘振兴;H9N2禽流感灭活疫苗免疫增强剂研究[D];南京农业大学;2012年

7 肖红;禽流感H9N2亚型病毒样颗粒疫苗佐剂的筛选[D];西南大学;2016年

8 林秋敏;麻鸭H9N2亚型禽流感病毒生物学特性研究[D];福建农林大学;2011年

9 杨达;H9N2亚型禽流感病毒冷适应致弱活疫苗候选株的培育及冷适应表型相关基因确定[D];扬州大学;2016年

10 田震;免疫增强剂对H9N2亚型禽流感疫苗免疫的影响[D];南京农业大学;2013年

本文编号：2618060