【摘要】：粪类圆线虫病是流行于亚热带的寄生虫病之一,危害严重。粪类圆线虫有着较复杂的生活史,包括体外自由生活阶段和体内寄生阶段。其中感染性三期幼虫(iL3)是粪类圆线虫自由生活阶段唯一具有入侵宿主能力的幼虫,iL3发育为寄生性雌虫(pF)的过程不仅仅是一个简单的发育过程,更是粪类圆线虫从自由生活阶段进入寄生阶段一个非常重要的转变过程。研究这两个时期之间的发育调控机制以及iL3的入侵机制对寻找粪类圆线虫药物靶标和疫苗候选分子具有非常重要的作用。近年来长非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)由于在转录调控方面发挥重要作用而备受研究者们的关注。已有的研究证实,lncRNA参与寄生虫感染和入侵宿主过程中毒力因子的表达,对寄生虫成功寄生发挥了重要的作用。并且很多研究表明寄生虫通过分泌细胞外囊泡与宿主进行信息交流,调控宿主免疫。因此本研究从lncRNA和细胞外囊泡两方面研究iL3和pF之间的发育调控机制以及iL3入侵宿主的感染机制,为研究粪类圆线虫药物标靶和疾病的控制提供新的视角。对粪类圆线虫lncRNA和细胞外囊泡研究结果如下:1.粪类圆线虫转录组测序质量将2个不同发育阶段的粪类圆线虫RNA样品进行检测,RNA样品检测合格后,通过去除样品rRNA、反转录,第一链合成、第二链合成、末端修复,3’加A、连接接头,片段选择、含U链降解等步骤构建文库。文库质控合格后,利用转录组测序技术在粪类圆线虫中获得了89%以上的高质量测序片段,感染性三期90%、寄生性雌虫83%以上的测序片段能够比对到参考基因组上,测序质量较高,能够反映粪类圆线虫转录组情况。2.LncRNA的筛选LncRNA为一类长度200 bp的长链非编码RNA,根据lncRNA的特点进行一系列筛选。首先保留x、j、o、u、i以及长度大于等于200 bp的转录本,筛选得到7126个转录本。其次,筛选表达量FPKM1、readscount10以及编码能力预测CPC(score0)和CNCI(score0)都注释为非编码的转录本,最后取其交集获得可信较高的lncRNA 1206条。3.LncRNA特征分析对筛选出来的lncRNA进行分类,并对其长度分布和外显子个数等基本特征进行分析。根据其在基因组上的位置,粪类圆线虫lncRNA可分为4类,其中497个基因间长链非编码RNA,17个内含子lncRNA,586个反义lncRNA和106个正义lncRNA。大多数(41%)lncRNA为基因间lncRNA,这与大多数报道的研究结果一致。基因结构分析发现大多数lncRNA(79%)含有两个外显子,只有约1%的lncRNA外显子数目大于6个。相比于mRNA,lncRNA含有较少的外显子。lncRNA长度分布范围200 nt至3000 nt以上,其中61%lncRNA长度在1500 nt以下,表明大部分的lncRNA的序列长度小于蛋白编码基因的长度。4.LncRNA功能分析通过cis和trans方式对lncRNA的功能进行分析,KEGG数据库功能注释发现粪类圆线虫lncRNA的靶基因可能参与了信号转导、转录、转运和代谢等多个生物学过程。5.差异表达lncRNA qRT-PCR验证分析发现两个不同发育阶段共有635个差异lncRNA,其中309个lncRNA是在感染性三期中下调表达,326个lncRNA在寄生性雌虫中上调表达。根据lncRNA差异分析结果,从中挑选出8个在两个时期具有差异表达的lncRNA基因进行荧光定量PCR实验,分析不同发育时期lncRNA的表达差异。结果显示8个lncRNA的表达趋势和利用RNA-seq及生物信息学方法计算出来的表达量一致,证明本次数据分析的准确性。这些工作为今后研究粪类圆线虫lncRNA分子功能奠定了基础。6.粪类圆线虫感染性三期细胞外囊泡的研究本研究从粪类圆线虫感染性三期幼虫(iL3)体外培养上清中分离细胞外囊泡并进行鉴定。首先,确立收集、纯化粪类圆线虫iL3的方法,建立在体外培养条件,之后收集粪类圆线虫体外培养20-24 h的上清液,用超速离心法分离出细胞外囊泡。通过透射电镜(Transmission Electron Microscopy,TEM)观察磷钨酸负染的细胞外囊泡,可见直径约为100-200 nm的典型杯托状囊泡结构,对粪类圆线虫细胞外囊泡总蛋白进行质谱鉴定,比对Uniprot蛋白数据库,共有17种蛋白被鉴定,其中包括细胞外囊泡标志性蛋白延伸因子。综上所述,通过对粪类圆线虫lncRNA和细胞外囊泡的研究,不仅对粪类圆线虫lncRNA和细胞外囊泡的研究提供全新的认识,并可为将来筛选粪类圆线虫病的分子标记奠定理论基础。
【图文】：
华中农业大学 2019 届硕士研究生毕业论文（autoinfectivelarve,L3a） (图 1-1)。患者免疫力较强时，体内维持一个非常低的自感染长期隐形感染。当宿主免疫力降低或患了免疫缺陷等病症时自感染则会慢慢增强导致虫子在体内大量繁殖，严重时出现弥散性感染(Keiseretal2003)。幼虫在体内各器官移行时会扩散细菌和真菌引起脑膜炎，，败血症和肺炎等症状，引发重度感染而死亡(Grove 1996, Keiser et al 2003, 李友松等 2003)。
lncRNA分类(RinnandChang2012)
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.731
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