杂合肽MB7R抑菌机理研究及在Sf9细胞中串联表达

发布时间：2020-04-10 04:05

【摘要】：抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是由生物体产生具有抗微生物活性的短肽,通常由6-60个氨基酸组成,呈现酸碱稳定性和热稳定性,抗菌谱较广。杂合方法是一种近年来兴起的抗菌肽改造策略,将两种或两种以上具有不同特性的抗菌肽融合产生新的抗菌肽,引入不同抗菌肽的特性,定向对抗菌肽进行改造。因此,通过杂合方式对抗菌肽氨基酸序列进行改造,提高抑菌活性、降低细胞毒性已成为抗菌肽研究的热点与难点。以本课题组发现的家蝇抗菌肽MDAP-2为母肽,与抗菌活性强的BuforinⅡ衍生肽的α-螺旋区域(3×RVVR)进行杂合,通过生物信息学工具对杂合结果进行分析并筛选出优势肽MB19(KFFTLLARVVRRVVRRVVR)。利用氨基酸替换方法设计杂合肽MB5R[MB19氨基酸序列中5号位亮氨酸(L)被精氨酸(R)替换]、MB7R[MB19氨基酸序列中的7号位丙氨酸(A)、5号位亮氨酸(L)被替精氨酸(R)替换]、MB19n(MB19的C-末端进行酰胺化修饰),通过提高正电荷含量、降低疏水性和疏水力矩等方式提高杂合肽的抑菌活性、减小细胞毒性。利用化学方法合成上述4条杂合肽,通过体外抑菌活性实验、细胞毒性实验、溶血活性实验和稳定性实验等筛选出抑菌活性更强、细胞毒性更低、稳定性更好的的杂合肽MB7R;通过细胞外膜通透性实验、内膜通透性实验、扫描电镜分析、透射电镜分析、DNA阻滞实验证实MB7R可以通过破坏细菌细胞膜与细菌DNA结合杀死细菌。在获得抗菌活性强、细胞毒性低的杂合肽MB7R基础上,利用同尾酶构建MB7R多聚串联体,增大目的基因长度。通过Bac-to-Bac系统转座原理,将目的基因12MB7R插入到pFastBac中的表达框位点上,经Tn7转座子将重组的pFastBac-12MB7R插入到Bacmind的Tn7表达框位点上,成功构建穿梭载体Bacmid-12MB7R。通过脂质体转染将重组杆状病毒质粒转染到Sf9昆虫细胞中,成功表达了分子量约为28.38 kDa串联蛋白体12MB7R,反复侵染获得高滴度病毒,利用Western Blot优化表达条件,为进一步扩大杂合肽MB7R制备及兽医临床应用奠定基础。主要实验结果如下:1.利用杂合方法设计杂合抗菌肽,通过生物信息学分析筛选出1条优势肽MB19,在MB19基础上利用氨基酸替换方法优化设计3条衍生肽(MB5R、MB7R和MB19n),化学合成上述4条杂合肽,利用体外抑菌实验、细胞毒性实验、溶血活性实验和稳定性实验等筛选出1条活性好的杂合肽MB7R。2.通过细胞外膜通透性实验(NPN)、内膜通透性实验(ONPG)证实,杂合肽MB19、MB5R、MB7R对细菌细胞膜具有破坏作用;通过扫描电镜和透射电镜对菌体细胞膜及内容物进行观察,证实了杂合肽MB7R作用靶点是细菌细胞膜;DNA阻滞实验表明,杂合肽破坏细胞膜进入胞内后可以与DNA作用,杀死细菌。3.成功构建了pFast-12MB7R供体质粒并产生Bacmid-12MB7R重组杆状病毒;利用脂质体转染法成功侵染Sf9昆虫细胞,成功表达了分子量约为28.38 kDa的串联蛋白体12MB7R,利用Western Blot优化侵染时间,病毒侵染Sf9细胞72h时蛋白表达量最高,通过Ni~(2+)亲和层析纯化获得串联蛋白体12MB7R。为杂合肽MB7R大量制备及兽医临床应用奠定基础。
【图文】：

A BC D图1.1 抗菌肽构象：（A）α-螺旋型抗菌肽 （B）无规则型抗菌肽 （C）β-折叠型抗菌肽 （D）环状结构抗菌肽Fig.1.1 Antimicrobial peptide conformation: （A）α-helical antimicrobial peptide（B）Irregularantimicrobial peptide（C）β-foldable antimicrobial peptide（D）Ring-shaped antimicrobial peptide1.4 抗菌肽分子设计及改造现状在实际的生产生活种，虽然已有少数的抗菌肽产品进入到市场中，但多数抗菌肽因为产量低、合成成本高、稳定性差、毒性强等问题，限制了其临床应用。因此对通过对已有抗菌肽分子进行结构改造、修饰来降低其毒性、提高选择性已成为抗菌肽研究的热点与难点[13]。1.4.1 氨基酸残基设计通过在抗菌肽肽链中插入带正电荷氨基酸残基、替换氨基酸残基及改变亲水、疏水性氨基酸比例进行抗菌肽设计，，已成为抗菌肽分子改造的研究热点。Ahn等[14]和Hawrani等[15]研究证实在?

1.3.2 杂合肽的二级结构测定圆二色光谱用来检测杂合肽在模拟细胞膜中亲水环境和疏水环境的二级结构。如图 1.2 所示，杂合肽 MB19、MB5R、MB7R 在 PBS 模拟的亲水环境中没有明显的 α-螺旋，呈现无规则卷曲结构。在 50%TFE 模拟的疏水环境中被诱导形成α-螺旋结构（波长在208 nm和222 nm处有两个明显的最低峰），表示MB19、MB5R、MB7R 在疏水环境中易被诱导成 α-螺旋结构。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S859.7

【参考文献】

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4 黎观红;洪智敏;贾永杰;瞿明仁;;抗菌肽的抗菌作用及其机制[J];动物营养学报;2011年04期

5 王莹;胡桂学;;食品级乳酸菌表达系统的研究进展[J];中国畜牧兽医;2010年07期

6 李国栋;钱承军;陆敏;孙睿华;黄青山;黄芳;;一组人工合成抗菌肽的研究[J];微生物学报;2006年03期

7 高向阳,陈念,林壁润,姚汝华;短杆菌肽S的研究进展[J];生命科学研究;2004年S1期

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9 朱帮福,卢兹凡;昆虫杆状病毒表达系统的研究进展[J];细胞与分子免疫学杂志;2002年06期

10 韩新燕,汪以真,许梓荣;哺乳动物抗菌肽的研究进展[J];中国兽医学报;2002年02期

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本文编号：2621723