热休克蛋白B7在酮病奶牛脂肪组织氧化应激中的作用研究

发布时间：2020-04-11 16:04

【摘要】：围产期奶牛由于食欲下降,干物质摄入减少,而能量需求增多,容易引起能量负平衡。在这种状态下,机体会大量动员脂肪组织,以弥补能量需求。脂肪动员产生游离脂肪酸,其在肝脏不完全氧化会产生大量酮体,容易导致奶牛酮病。酮病奶牛表现为系统性氧化应激,而代谢旺盛的脂肪组织是否存在氧化应激,目前尚不清楚。热休克蛋白(HSPs)是机体由于受到化学、物理和生物因子等刺激而导致应激反应发生时产生的抵抗应激的一类蛋白质。近几年发现,热休克蛋白B7(HSPB7)在抗氧化、保护机体损伤等方面发挥重要作用,然而,在酮病奶牛脂肪组织中HSPB7是否有抗氧化作用,目前尚不清楚。此外,众所周知核因子E2相关因子2(NFE2L2)在机体内主要参与抗氧化过程,HSPB7与NFE2L2信号通路是否有联系,还待进一步研究。因此,本实验通过体内采集临床酮病奶牛和健康奶牛脂肪组织,检测临床酮病奶牛脂肪组织中是否存在氧化应激及HSPB7和NFE2L2的表达变化。体外分离培养犊牛脂肪细胞,分别添加不同浓度的H_2O_2,模拟体内氧化应激状态,研究犊牛脂肪细胞氧化应激对HSPB7、NFE2L2及其下游靶基因血红素氧合酶-1(HMOX1)和NADH醌氧化还原酶1(NQO1)的影响,并通过转染过表达HSPB7的腺病毒和干扰HSPB7的siRNA,以期了解HSPB7对犊牛脂肪细胞抗氧化应激的作用及机制。体内实验测定了健康奶牛和临床酮病奶牛脂肪组织中抗氧化应激指标超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性和氧化应激指标丙二醛(MDA)的含量,结果表明临床酮病奶牛脂肪组织中的MDA含量显著高于健康奶牛,而SOD和GSH-Px活性显著低于健康奶牛,说明临床酮病奶牛脂肪组织中存在氧化应激。同时,检测了脂肪组织中HSPB7和NFE2L2的表达量,结果表明,临床酮病奶牛脂肪组织中HSPB7和NFE2L2的表达量均高于健康奶牛,说明HSPB7在临床酮病奶牛脂肪组织中发挥作用,且NFE2L2信号通路被激活。体外培养犊牛脂肪细胞,添加不同浓度的H_2O_2(0、25、50、100、200和400μM)作用2 h。结果表明,与对照组相比,添加H_2O_2浓度为25、50、100、200和400μM的实验组活性氧(ROS)和MDA的含量随着H_2O_2浓度增加而显著升高,SOD和GSH-Px的活性随着H_2O_2浓度增加而显著降低。此外,25、50和100μM H_2O_2促进HSPB7和NFE2L2 mRNA和蛋白表达,并促进NFE2L2下游靶基因HMOX1和NQO1的mRNA表达,而200和400μM H_2O_2抑制HSPB7和NFE2L2 mRNA和蛋白表达,并抑制NFE2L2下游靶基因HMOX1和NQO1的mRNA表达。体外培养犊牛脂肪细胞,转染过表达HSPB7的腺病毒(Ad-HSPB7)作用48 h,添加200μM H_2O_2作用2 h。结果表明,过表达HSPB7减弱H_2O_2对NFE2L2、HMOX1和NQO1表达的抑制作用,且过表达HSPB7增加SOD和GSH-Px的活性,降低MDA和ROS的产生,从而改善H_2O_2诱导的氧化应激。将脂肪细胞转染小干扰RNA(si-HSPB7)48 h,添加200μM H_2O_2作用2 h。结果表明,干扰HSPB7加剧H_2O_2对NFE2L2、HMOX1和NQO1表达的抑制作用,且干扰HSPB7加剧H_2O_2对SOD和GSH-Px活性的降低,并增加MDA和ROS的产生,表明干扰HSPB7会加重犊牛脂肪细胞中的氧化应激。以上结果表明,临床酮病奶牛脂肪组织存在氧化应激,且HSPB7和NFE2L2的表达升高。在犊牛脂肪细胞中,HSPB7通过激活NFE2L2信号通路发挥抗氧化作用。
【图文】：

脂肪组织 TG 分解生成的 NEFA 是某些代谢性疾病炎，也是奶牛过渡期代谢性疾病（脂肪肝、酮症）和感染性）的重要诱导因素[40,41]。高浓度 NEFA 可激活炎症通路，因子 α（tumor necrosis factor α, TNF-α）、白介素因子的期奶牛对乳腺炎、子宫炎等感染性疾病很敏感。进入肝脏外，也可在肝细胞中重新酯化生成 TG，TG 必须通过极ow-density lipoprotein, VLDL）才能输出肝脏，但由于反刍奶牛肝脏合成 VLDL 的速度非常慢，但合成 TG 的速度与肝脏的 TG 合成速率超过了水解或 VLDL 转运速率时，就肝会进一步加重机体炎症反应，进而增加机体的患病风险牛脂肪组织提供能量缓解 NEB 的同时，其代谢物也可能致一系列疾病发生概率增加，，因此，对于脂肪组织的代谢渡期奶牛疾病的预防和治疗是很必要的。

信号通路,细胞保护,蛋白,分子

并与一种小的MAF蛋白质异二聚体化，异二聚体识别ARE[143]，即存在于NFE2L2靶基因调控区的增强子序列，对关键转录因子的激活至关重要。NFE2L2可影响近500个编码蛋白质的基因的表达，这些蛋白质包括氧化还原平衡因子、解毒酶、应激反应蛋白和代谢酶等[144]。3.2 NFE2L2 信号通路NFE2L2信号通路是细胞对抗氧化应激的重要机制之一[145]。在正常生理状态下，NFE2L2通过与Keap1结合并锚定在细胞质中，保持抑制状态。然而，在氧化应激状态下，NFE2L2进入细胞核与MAF异二聚体化，并与ARE结合，随后激活下游抗氧化基因，产生强大的抗氧化作用，如血红素加氧酶-1（HMOX1）、NADH醌氧化还原酶1（NQO1）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）等（图2）。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.23

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