猪札幌病毒ELISA检测方法及病毒样颗粒基因工程疫苗研究

发布时间：2020-04-11 23:20

【摘要】：札幌病毒(sapovirus,Sa V)属于杯状病毒科(Caliciviridae)、札幌样病毒属(Sappora-like virus),是单股正链的一种RNA病毒。可以引起人和动物的急性病毒性胃肠炎及腹泻,通常通过粪便和口腔交叉感染。猪札幌病毒(Porcine Sapovirus,Po Sa V)能够引起仔猪腹泻并广泛存在于世界范围内。近年来,Sa V的研究内容相对较少,最新研究显示,Sa V能够感染多种物种,不同基因型的Sa V在遗传进化方面和抗原表位上有很多相似之处,并且已发现来自于人源和猪源重组的Sa V毒株,说明Sa V存在一定的跨种传播能力,严重时会对公共卫生安全构成潜在的威胁。因此,研究较方便的ELISA诊断方法和免疫原性较好、安全性较高的预防性疫苗抗击病毒感染是一个紧迫的任务。VP1序列为猪Sa V(Porcine Sapovirus,Po Sa V)的主要衣壳蛋白组成成分,可分为S区和P区。以Sa V(CH430株)的RNA作为扩增模板得到目的基因并将其克隆到p ET-30a载体中,并将成功构建的阳性质粒转入BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达。纯化出Po Sa V的VP1以及S区和P区蛋白,分别将S蛋白和P蛋白进行HRP标记,通过优化ELISA包被浓度和封闭时间,一抗二抗稀释度,封闭时间等条件成功建立了Po Sa V双抗原夹心ELISA,为Sa V的血清学诊断提供了依据。同时将原核表达的VP1、P、S蛋白纯化后分别免疫了家兔和仔猪,制备了两种动物源的高免血清,为研究免疫原性和蛋白检测等提供了实验基础。VP1是Po Sa V virus-like particles(VLPs)组装的必需区,将Po Sa V VP1编码蛋白的基因序列插入p Fast BacTM HTB载体中,转入DH10BACTM感受态细胞构成阳性重组杆粒;用重组阳性的杆粒转染sf9细胞得到重组杆状病毒,将其感染细胞至第三代杆状病毒,提取杆状病毒RNA和DNA,经PCR扩增鉴定外源基因没有丢失;采用TCID50方法确定重组病毒滴度;将重组病毒感染sf9细胞进行蛋白表达。表达的蛋白通过共聚焦显微镜以及Western-blots试验证明外源基因成功在昆虫细胞内表达,相对分子质量为58-61k Da,与预测蛋白大小一致,并且为非分泌型蛋白,主要分布在细胞核周围以及细胞质中。蛋白经过浓缩处理后,进行蔗糖密度梯度离心纯化,通过电子显微镜观察VLPs大小和形态均模拟天然病毒结构。同时,将Po Sa V VLPs免疫仔猪,通过建立的双抗原夹心ELISA方法检测抗体的生成并且稳定后,进行了攻毒试验,免疫组的仔猪可以有效地抑制病毒在肠道内的复制,而对照组不能抑制病毒的复制。证明VLPs刺激机体产生的抗体能够阻止机体组织与病毒表面的抗原结合,阻止病毒黏附靶细胞受体,防止侵入细胞,从而起到保护的作用。Sa V-VLP疫苗对于猪Sa V的防治具有良好的前景,可作为预防猪Sa V的疫苗之一,本研究为Po Sa V基因工程亚单位疫苗的研究奠定了基础。
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.4;S852.65

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本文编号：2623968