弓形虫TR基因与ROP18基因缺失株的构建及其生物学功能研究

发布时间：2020-04-12 01:19

【摘要】：刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)可寄生于多种动物的有核细胞。目前缺乏针对弓形虫病的具体治疗方案,因此有必要开发研制有效的弓形虫疫苗,了解弓形虫的免疫逃避机制是研制新型疫苗的重要一步。弓形虫感染宿主时可激发宿主的天然免疫反应以清除弓形虫:一方面通过IFN-γ激活信号转导与转录激活因子1(STAT1),引起巨噬细胞等细胞产生过量的活性氧(ROS)来杀伤弓形虫,另一方面通过IFN-γ诱导的免疫相关GTP酶(IRGs)信号通路募集IRGs到纳虫泡膜(PVM)上裂解纳虫泡(PV),进而通过细胞自噬清除虫体。弓形虫则可分泌多种因子逃避免疫攻击:一方面,弓形虫可产生多种过氧化物酶以抵抗活性氧(ROS)的损伤,本实验室前期研究表明在弓形虫分泌的排泄抗原(ESA)中存在大量的硫氧还蛋白还原酶(TR),在逃避宿主的活性氧损伤中发挥重要的抗氧化作用,使得弓形虫在宿主体内生存并繁殖。另一方面,有研究表明棒状体蛋白18(ROP18)能特异性结合宿主细胞内的IRGs,防止宿主免疫作用对PV的破坏,进而避免弓形虫裸露而遭到宿主细胞质中ROS的攻击并逃避细胞自噬。所以我们推测ROP18和TR有可能在弓形虫抵抗宿主的免疫清除过程中发挥协同作用,基于此假设我们开展了以下实验。首先,进行了ROP18蛋白的表达及多克隆抗体的制备。采用PCR方法扩增ROP18的截短基因,构建pET-30a-ROP18重组质粒进行蛋白表达。ROP18蛋白以包涵体形式表达,故采用KCl染色切胶法回收目的蛋白,并免疫雌性昆明小鼠制备多克隆抗体。间接免疫荧光(IFA)试验显示ROP18主要分布于弓形虫速殖子的胞浆内,且棒状体常存在的部位呈现较强荧光。本研究成功获得重组蛋白ROP18及ROP18多克隆抗体,为ROP18特性与功能的研究奠定基础。其次,进行了ROP18基因缺失株(RH-ROP18-KO株)和互补株(RH-ROP18-CO株)的构建及生物学功能的研究。运用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功获得了RH-ROP18-KO株和RH-ROP18-CO株。与RH株相比,RH-ROP18-KO株的体外入侵细胞能力及增殖速率降低、对小鼠的毒力减弱,同时采用反转录(RT-PCR)的方法扩增巨噬细胞的Irga6基因,构建pGEX-6p-1-Irga6重组质粒进行蛋白表达,免疫雌兔获得多克隆抗体用于IFA试验,结果显示Irga6在RH-ROP18-KO株PV表面聚集的荧光强度明显高于RH株,佐证了ROP18可通过磷酸化Irga6阻止其在PVM上聚集,从而防止PV被破坏。最后,为探索ROP18与TR在弓形虫抵抗宿主的免疫清除过程中是否发挥协同作用,进行了TR基因缺失株、ROP18和TR双基因缺失株的构建及生物学功能的研究。同样运用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在RH株基础上缺失TR基因,息疟定筛选获得TR基因缺失株(RH-TR-KO株);同时构建具有氯霉素抗性的ROP18单基因缺失虫株,再在此虫株基础上缺失TR基因,用息疟定进行筛选以获得ROP18和TR双基因缺失株(RH-ROP18-TR-KO株)。RH-ROP18-TR-KO株的体外入侵细胞能力及增殖速率比RH株及单基因缺失虫株低,通过小鼠的毒力实验显示RH-ROP18-TR-KO株感染小鼠的存活时间比RH株及单基因缺失虫株感染的小鼠存活时间要长,这些研究表明ROP18和TR可能通过具有协同作用的不同机制来逃避宿主的免疫攻击。
【图文】：

文 TP）从细胞质迁移到无毒力的弓形虫的 PVM 上06; Martens et al., 2005)。在上调 IFN-γ 后，将 IRG PV 的囊泡化、破裂以及弓形虫的死亡(Howard et ，不同类型的弓形虫虫株对于聚集 IRGs 到 PVMGs 到 PVM 上，因此它们的速殖子能有效地被宿御因子来阻断宿主细胞的清除机制，因此它们能繁aylor, 2007)。细胞还通过产生氧化应激微环境来抵抗弓形虫(H粒细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞可通过释放超氧导致氧化应激微环境，对弓形虫产生毒性(Engin

士学位论文 细胞期间，棒状体蛋白可由弓形虫直接分泌到宿主细胞中。其中细胞质中的丝氨酸（Ser）/苏氨酸（Thr）激酶，被鉴定为主要的r et al., 2006)。在分泌到宿主细胞后，ROP5 和 ROP18 通过富含 NH）结构域连接到 PVM 的细胞胞质面(Etheridge et al., 2014; Fen012; Reese and Boothroyd, 2009)。ROP18 的作用对象为免疫相关 PVM 上积累，从而保护 PV 的完整性并免于被破坏(Fentress et al.,einfeldt et al., 2010)。有研究表明，ROP18 可促进 P65 蛋白的降解，，ROP18 在 ROP5 和 GRA7 的调控下可直接磷酸化 Irga6(Herma促进 ROP18 激酶活性(Behnke et al., 2012)，，随后 ROP18 激酶 al., 2012; Niedelman et al., 2012; Reese et al., 2014)。此外，弓形虫径，ROP18 可通过体外线粒体凋亡途径抑制宿主细胞凋亡(Wu e弓形虫的存活。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.72

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本文编号：2624088