贵州禽白血病病毒序列分析与抗禽白血病中药筛选

发布时间：2020-04-13 00:47

【摘要】：禽白血病(Avian Leukosis,AL)是由禽白血病病毒(Avian Leukosis virus,ALV)引起的以造血细胞恶性增生为主要特征的多种肿瘤性疾病的总称。因其能引起肿瘤,造成产蛋量下降,且能使机体产生严重的免疫抑制,故对养禽业危害巨大。禽白血病的控制目前只能依靠种群净化,筛选到能抗禽白血病病毒的特效药对该病的防治具有重要意义。研究显示,A亚型和J亚型禽白血病病毒是威胁我省家禽业的主要亚型。本研究首先对贵州省J亚型禽白血病病毒流行毒株进行PCR鉴定及序列分析,从其分子生物学特性推测近几年贵州省禽白血病病毒的流行特点,同时以J亚型标准毒株为对象,从18种中药中筛选出对其复制有抑制作用的中药,并对中药的最佳作用方式作进一步探索。研究结果为禽白血病的防治奠定了基础。1.贵州省ALV-J临床病例检测及gp85序列分析:本研究设计了一对J亚型禽白血病病毒特异性引物,对25例临床病例进行PCR扩增,鉴定出17例ALV-J阳性病例,阳性率为68%(17/25)。选取其中3例ALV-J亚型阳性病例病料,对其gp85基因进行克隆、测序分析、生物学软件分析。结果显示:(1)3株流行株(GZ161219、GZ170813和GZ180116)gp85基因大小均为924bp,核苷酸相似性在98.3%-99.5%之间,流行株与J亚型参考株AHaq02(Gen Bank登录号:KF534753)相似性最高,为98.2%-99.7%,与其它亚型标准株的相似性仅为49.1%-51.2%;(2)用DNAStar软件对3株流行株的gp85基因进行推导,3者均能编码308个氨基酸,氨基酸序列相似性分析结果与核苷酸相一致,与J亚型标准株HPRS-103(Gen Bank登录号:Z45390)和GZN49(Gen Bank登录号:KX077613)相比,突变率低于3%;(3)对3株流行株gp85推导的氨基酸进行二级结构的预测,结果显示无规卷曲的含量最高,其次是延伸链,α-螺旋与β-转角含量最低。预测gp85基因编码蛋白的B细胞表位各参数,结果显示,gp85基因编码蛋白具有较好的亲水性,氨基酸柔性区域分布较均匀,抗原指数和表面可及性都较高,综合各参数,得到了gp85蛋白可能的优势表位。3株流行株的gp85蛋白主要存在gp85蛋白家族保守结构域,均不存在跨膜结构,也无信号肽存在。研究结果为贵州省J亚型禽白血病病毒流行毒株的生物学特性和流行变异情况提供参考数据。2.ALV p27原核表达及其高免血清的制备:(1)设计一对p27基因特异性引物,将目的基因克隆至p Cold I质粒、转入大肠杆菌BL21、经IPTG诱导表达、超声裂解,用SDS-PAGE检测。结果,可见26k D大小的特异条带,重组蛋白His-p27主要以包涵体的形式存在。(2)重组蛋白镍柱纯化后,免疫健康小鼠、采集血清、ELISA测其效价、Western Blotting鉴定。结果表明,本研究成功获得了针对p27蛋白的高免血清,其血清效价为1:3200,研究结果为ALV的检测及研究p27蛋白的功能奠定了基础。3.中药最大安全浓度的测定:选取18种中药(黄芪、贯众、鸡血藤、墨旱莲、黄芩、赤芍、仙鹤草、丹参、蒲公英、益母草、白花蛇舌草、淫羊藿、丹皮、郁金、夏枯草、土茯苓、栀子、鱼腥草),采用水煎法制备中药药液,并用细胞病变法和MTT法对中药的最大安全浓度(TC0)进行测定,结果显示:(1)不同的中药细胞毒性不同。(2)18种中药中细胞毒性最小的是黄芪,TC0为62.5mg/m L;毒性最大的是贯众,TC0为0.061mg/m L,且部分中药对细胞的毒性会随作用时间的增加逐渐增大。(3)两种检测方法相比,MTT法更为敏感、准确,故选择MTT法的测定结果作为药物的TC0。测定结果可为下一步实验奠定基础。4.不同中药对ALV转录水平的影响:用ALV p27抗原检测试剂盒对ALV毒株的TCID50进行测定,并用Reed-Muench法计算结果,测得该病毒的TCID50为10-3.8/0.1 m L。参考较为保守的gp37基因以及18sr RNA基因序列设计荧光引物,构建标准质粒,成功建立了特异性强、扩增效率高的标准曲线。设立分直接灭活组、预防组和治疗组3个组别,将中药和病毒分别或同时接种于DF-1细胞,于37℃培养72h后,提取各孔的总RNA,反转录成c DNA,以18sr RNA为内参基因,进行q PCR,得到Ct值,用2-ΔΔCt方法计算差异。结果表明,黄芪在细胞水平对ALV gp37基因m RNA表达的抑制作用最强;郁金、益母草、土茯苓也有一定的抑制作用;栀子、赤芍、蒲公英及贯众对ALV gp37基因m RNA表达几乎没有影响。
【图文】：

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贵州大学 2018 届硕士学位论文个亚群，由王鑫等分离并命名，与其它几个亚群同源性较毒血症,并诱发一定比例的淋巴细胞肿瘤（王鑫等，2012；Mi态结构的反转录病毒，形状为类球形（图 1），直径约为 80~14层，内层是直径约为 40nm 的核芯，包含二倍体 RNA、反酶(IN)，中层是病毒的衣壳，呈 20 面体对称，外层为囊突（Bova C.Aet al., 1986;Feng M et al.,2016）。

基因组结构

图 2 ALV 基因组结构Fig 2 The genomic structure ofALVgag 基因约 2100bp 左右大小，gag 基因编码的多聚前体蛋白 Pr76 在蛋白酶 p15作用下，会形成 3~6 种非糖结构蛋白，从氨基端到竣基端依次为基质蛋白 p19 (MA)，， p10，病毒群特异性抗原衣壳蛋白 p27 (CA)，参与核酸加工的核衣壳蛋白 p12 (NA)，与蛋白前体剪切的天冬氨酸酶蛋白酶 p15 (PR)。p27 是 ALV 的主要群特异性抗原，序高度保守，存在许多易于检测的病毒抗原位点，是制备抗体的首选抗原。p2，，p10 的体功能尚不清楚（Zhang et al.,2010;Thuy et al.,1999）。pol 基因约为 2610bp 左右，编码的蛋白经蛋白酶 p15 剪切产生反转录酶 p68（RT）整合酶 p32（IN）。RT 分子量大小为 68kDa，负责将病毒 RNA 反转录成前病毒 DNA，则负责将前病毒 DNA 整合到宿主染色体中（Calnek et al., 1997;Liu X et al.,2015）。gag 基因和 pol 基因较为保守，各亚群间的同源性高达 95~99%，而 J 亚群的 env因与 A、C、D 三个亚群的同源性仅有 41%左右，这很大程度上是受了 env 基因编码
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65;S853.7

【参考文献】