【摘要】：肝缺血再灌注损伤(Ischemia-reperfusion injury IRI)是临床上亟待解决的问题。近年研究表明,内质网应激(Endoplasmic reticulum stress ERS)在肝缺血再灌注中有着重要作用。对ERS反应途径的干预可能为肝脏IRI提供新的保护手段。富氢生理盐水(Hydrogen-rich saline HRS)具有抗氧化,抗炎,抗凋亡的作用,对各种器官IRI具有广泛的保护作用。近年来的研究发现,HRS能够通过抑制ERS,减轻肝IRI,然而其机制尚不明确,而HRS对于腹腔镜技术建立的小型猪肝脏缺血再灌注合并肝部分切除模型中ERS影响的研究尚未见报道。本研究采用腹腔镜手术建立小型猪肝脏缺血再灌注合并肝部分切除模型,并应用HRS干预,通过跟踪检测干预后肝脏组织学和ERS相关指标的变化,深入探讨了HRS对肝脏缺血再灌注合并肝部分切除术后ERS的影响。本实验选取18头健康小型猪,随机分为三组,分别为假手术组(Sham组)、模型组(IRI组)和HRS干预组(HRS组)(n=6)。Sham组仅进行翻动肝叶,维持气腹三小时,IRI组用腹腔镜手术建立右半肝缺血60 min合并左半肝切除模型,HRS组建立手术模型并门静脉置管,于再灌注前10 min、再灌注6 h、术后1 d、2 d、3 d经门静脉注射HRS(10 mL/kg)。各组分别于术前,再灌注即刻,术后即刻,术后1 d,术后3 d经腹腔镜手术采取肝脏组织,进行HE染色和电镜检测,并采用实时荧光定量PCR、免疫组化、Western blot等方法检测肝中ERS参数变化情况,具体检查指标包括:内质网蛋白核心蛋白(GRP78),未折叠蛋白反应(Unfolded protein reaction UPR)信号分子(PERK、IRE1、ATF6、XBP1s、p-eIF2α),ERS凋亡相关蛋白(ATF4、CHOP、p-JNK)。为研究HRS对肝损伤的保护作用,我们对肝组织病理损伤变化进行了检测:HE染色显示,与Sham组相比IRI组各时间点观察到不同程度肝组织损伤:肝细胞索状排列被破坏,细胞肿胀,空泡变性,并存在有坏死性病变和炎症细胞浸润。与IRI组比较,HRS组各时间点的肝细胞基本呈索状排列,且HRS组中肝细胞坏死和炎症浸润显著减少;术后1 d电镜结果显示Sham组肝细胞微观结构正常;IRI组肝细胞线粒体和内质网肿胀,结构被破坏,糖原减少;HRS组肝细胞线粒体结构基本正常,内质网轻微肿胀。GRP78是内质网核心蛋白,为研究HRS对ERS的影响,我们检测了肝组织内GRP78表达水平变化:IRI组GRP78 mRNA表达水平分别于再灌注即刻、术后即刻、术后1 d、术后3 d显著高于Sham组(P0.01),于再灌注即刻、术后即刻、术后1 d、术后3 d显著高于HRS组(P0.01)。IRI组除术前外各时间点GRP78蛋白表达水平均显著高于Sham组(P0.01);HRS组GRP78蛋白表达水平分别于再灌注即刻、术后1 d、术后3 d显著低于IRI组(P0.01)。为进一步探究HRS对ERS影响的机制,我们对UPR信号分子mRNA和蛋白表达进行了检测:IRI组PERK、IRE1、ATF6 mRNA表达水平分别于再灌注即刻、术后即刻、术后1 d显著高于Sham组以及HRS组(P0.05或P0.01);IRI组PERK、IRE1、ATF6蛋白表达水平于再灌注即刻、术后即刻、术后1 d显著高于Sham组,于术后1 d显著高于HRS组(P0.05或P0.01)。ERS最终结果将导致内质网凋亡的产生,为此我们对ERS凋亡相关蛋白进行了检测:IRI组ATF4,CHOP,p-JNK蛋白表达水平于术后即刻、术后1 d、术后3 d均显著高于Sham组,于术后即刻、术后1 d均显著高于HRS组(P0.05或P0.01)。综上所述:(1)HRS显著改善肝缺血再灌注合并肝部分切除后的肝脏病理组织损伤,改善肝细胞超微结构。表明了HRS对肝损伤具有保护作用。(2)HRS能够抑制肝损伤导致的内质网核心蛋白的上调,抑制UPR三条信号通路,进而抑制内质网凋亡蛋白的表达。表明RHS能够抑制肝损伤中的ERS。
【图文】：
图 2-1 腹腔镜手术通路Figure 2-1 Operation pathway肝周围韧带，使肝叶充分游离。用左弯分离钳将胆带从胆囊管底部穿过，然后再从右内叶基部穿过；过；同时收紧两止血带，用双孔卡扣固定，将右半至图 2-5。
图 2-1 腹腔镜手术通路Figure 2-1 Operation pathway2.2.4.3 右半肝缺血使用电凝装置离断肝周围韧带，使肝叶充分游离。用左弯分离钳将胆囊管与肝实质分离，然后将一根自制的止血带从胆囊管底部穿过，然后再从右内叶基部穿过；然后将另一根带针止血带从右外叶基部穿过；同时收紧两止血带，用双孔卡扣固定，将右半肝入肝血流阻断。缺血 60 min。如图 2-2 至图 2-5。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S857.146
【参考文献】
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