微小隐孢子虫感染小鼠肠道细胞因子变化及差异表达MicroRNA的筛选

发布时间：2020-04-13 16:18

【摘要】：隐孢子虫(Cryptosporidium)是一种世界性分布的人兽共患寄生性原虫,寄生于宿主消化道上皮细胞刷状缘纳虫空泡,它会引起人和多种动物腹泻,尤其是它可引起免疫缺陷或免疫抑制者致死性腹泻,对人类和牲畜健康造成严重威胁。造成奶牛隐孢子虫病的主要有微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫及牛隐孢子虫。其中造成断奶前犊牛腹泻、消瘦、生长发育缓慢的主要是微小隐孢子虫。本病流行较广,可通过污水、粪便、食物相互传播,孢子化的卵囊经口进入消化道定殖,微创性损伤消化道造成病牛免疫力下降,给其他病原体入侵提供机会。根据河北省各个奶牛养殖场的流行病学调查,隐孢子虫的平均感染率为5.8%,导致奶牛养殖业经济损失惨重,目前尚无有效的治疗方法。因此,研究微小隐孢子虫的入侵及致病机制,对预防、治疗微小隐孢子虫病具有重要的意义。本试验建立微小隐孢子虫感染小鼠模型,取三周龄BALB/c小鼠,用醋酸地塞米松15g/ml免疫抑制1周,灌胃感染微小隐孢子虫,接种卵囊后分别在1d、3d、7d、14d分离小鼠小肠上皮细胞,提取mRNA后反转录成cDNA,利用荧光定量PCR分别检测IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6的相对表达量。结果显示感染后的小肠IFN-γ、TNF-α在1d、3d、7d、14d表达均显著升高(P0.05),且差异显著。IL-2在感染后1d、3d、7d表达量相对于对照组差异不显著(P0.05),14天表达量显著上升(P0.01)。IL-4在感染后1d、3d和7 d呈缓慢上升趋势,与对照组相比略有升高但差异并不明显(P0.05),感染后14天表达量升高,是对照组的5.04倍,相对于对照组差异显著(P0.01)。IL-6的表达在感染初期呈稳定趋势,在感染后1d、3d和7 d与对照组相比表达量差异显著(P0.05),均在对照组的2~3倍之间,感染后14天表达量略有下降,相对于对照组差异不显著(P0.05),但仍高于对照组。分析结果可知IFN-γ、TNF-α表达显著升高说明机体通过依赖于IFN-γ、TNF-α的调节机制从而阻止和限制微小隐孢子虫近一步的感染,同时诱导机体IL-2、IL-4、IL-6水平的升高,在感染的后期发挥调节作用。IFN-γ、TNF-α、IL-2是Th1型免疫应答主要的细胞因子,提示Th1型免疫应答与宿主抵抗微小隐孢子虫感染的免疫防御有关,以IL-4为代表的Th2型细胞免疫在抵抗及清除微小隐孢子虫感染中发挥作用。取感染微小隐孢子虫卵囊一周的小鼠,用Trizol(Invitrogen,USA)试剂盒提取其小肠组织总RNA,采用甲醛变性琼脂糖凝胶以及Bioanalyzer 2100对RNA进行质量检测,样品检测合格后,使用Small RNA Sample Pre Kit构建文库,文库构建完成后,先使用Qubit2.0进行初步定量,保证文库质量。将上述生成的文库送至北京诺禾致源科技有限公司进行HiSeq测序,对原始数据进行以下方面处理,即去除接头、污染序列及低质量reads,分别对试验组和对照组的microRNA表达量进行生物信息学分析;对差异表达的microRNA靶基因进行Geneontology(GO)富集分析和KEGG Pathways富集分析;通过实时定量PCR验证对差异表达microRNA进行验证。结果表明差异表达的microRNA共204个,其中表达量上调的有126个,下调的有78个;这些microRNA参与Ras信号通路,微生物感染、癌症途径、受体相互作用途径,以及趋化因子和细胞因子受体的相互作用等;实时定量PCR验证了部分差异表达microRNA(mmu-miR-10、mmu-miR-196、mmu-miR-27、mmu-miR-146、mmu-miR-145、mmu-miR-21、mmu-miR-1981、let-7i和mmu-miR-101),与高通量测序结果一致。通过双荧光素酶报告试验对筛选出的差异表达microRNA miR-196对靶基因TLR-11的作用进行验证,把TLR-11基因的部分3’UTR区连接到pmir-GLO载体上,将mmu-miR-196模拟物及载体一同转染进293T细胞中培养48小时。按照双荧光素酶报告基因检测系统试剂盒说明书利用多功能酶标仪检测出发光值。结果,相对于对照组,试验组的萤火虫荧光发光值相对于海肾荧光发光值的差异相对显著(P0.05)。证明miR-196能与TLR-11基因的3’UTR区特异性结合,从而判断TLR-11是miR-196的靶基因。
【图文】：

结合位点,基因,碱基,不完全图

-UTR 碱基正常链（176bp）AGAGCTGGACAAGAAAGAGATTAAGGACTGCAGGAATGCTGTTGTGCCAGCAGCAGAGGGAATGTGCTCTCATCACTAAAGCATGGGCTCACCAAATATATTAAATTCCACTGGGAGAGAAGTCTTTTAAAACACTGAAACTC’-UTR 碱基突变链（176bp）AGAGCTGGACAAGAAAGAGATTAAGGACTGCAGGAATGCTGTTGTGCGTCGTCGTGAGGGAATGTGCTCTCATCACTAAAGCATGGGCTCACCAATATATTAAATTCCACTGGGAGAGAAGTCTTTTAAAACACTGAAACTCG1 mRNA基因 3’-UTR 的第 2932-2954 碱基位置可能存在与miR-196不完全图 1 所示。

扩增曲线,实时荧光定量PCR,验证结果,反转录

图 4 反转录-实时荧光定量 PCR 引物验证结果esult of testing primers of reverse transcription quantitative reaM：DL-1000Marker1:IL-2 2:IL-4 3:IL-6 4:TNF-α 5:GAPDH 6:IFN-γ测定 1×105-1×101梯度倍比稀释 5 个浓度，分别扩增。反应结束后系统根据罗氏实时荧光定量 PCR 荧光量变化的扩增曲线。并用 LightCycler96 SW 1F-α、GAPDH、IL-2、IL-4、IL-6 扩增曲线如图 5 高，内参基因和目标基因扩增效率分别为 1.16、1.因扩增效率基本一致，说明引物扩增效率高，，具有
【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.723

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