醋氨酚诱导肝细胞损伤中JNK信号通路与HNF-1和GSTA1的作用研究

发布时间：2020-04-14 00:05

【摘要】：醋氨酚(APAP)是一种常见的临床解热镇痛药,代谢时产生有毒产物N-乙酰对苯醌亚胺,过量会导致药物性肝损伤。目前,普遍采用APAP诱导肝细胞损伤模型进行肝脏疾病的研究。肝细胞核因子-1(HNF-1)是调控肝脏特异性基因表达的转录因子,谷胱甘肽-S-转移酶A1(GSTA1)作为Ⅱ相药物代谢酶在解毒和细胞保护方面起关键作用,c-Jun-末端激酶(JNK)在机体中调节细胞代谢、分化,以及介导细胞凋亡。本研究采用APAP诱导药物性肝细胞损伤模型,研究HNF-1对GSTA1的调控作用,在此基础上,进一步开展了在肝细胞损伤中JNK信号通路与HNF-1和GSTA1的作用研究,为药物性肝损伤治疗和研发新治疗靶点奠定基础。本实验在复制APAP诱导肝细胞损伤模型基础上,首先研究HNF-1对GSTA1的调控作用,试验分为8组:对照组、模型组(APAP浓度10 mM)、C2-神经酰胺组(APAP浓度10mM和C2浓度6μM、8μM、10μM),奥替普拉组(APAP浓度10 mM和OL浓度6μM、8μM、10μM),应用试剂盒检测细胞上清液转氨酶(ALT、AST)活性;采用RT-PCR法检测肝细胞中GSTA1 mRNA的表达;应用Western blot法检测细胞中HNF-1和GSTA1的蛋白表达;构建重组质粒pGSTA1-1298-LUC和GSTA1启动子的结合位点HRE定点突变质粒pGSTA1-ΔHNF1-LUC转染HepG2细胞,双荧光素酶测定系统检测细胞荧光素酶相对活性。并进一步开展了在肝细胞损伤中JNK信号通路与HNF-1和GSTA1的作用研究,试验分为7组:对照组、模型组(APAP浓度10 mM)、抑制剂组(APAP浓度10 mM和SP浓度2μM)、OL组(APAP浓度10 mM和OL浓度8μM)、C2组(APAP浓度10 mM和C2浓度8μM)、AP+SP+OL组(APAP浓度10 mM、SP浓度2μM和OL浓度8μM)和AP+SP+C2组(APAP浓度10 mM、SP浓度2μM和C2浓度8μM),应用试剂盒检测细胞上清液转氨酶活性及肝细胞指标(SOD、MDA、GSH和GSH-Px)水平;采用RT-PCR法检测细胞中HNF-1和GSTA1mRNA的表达;应用Western blot法检测细胞中JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、HNF-1、GSTA1、Bax和Caspase-3的蛋白表达量。研究结果表明:(1)APAP浓度为10 mM作用HepG2细胞10 h,成功复制肝细胞损伤模型。(2)C2与OL对肝细胞损伤作用表明,C2可以加剧由APAP诱导的肝细胞损伤,OL可以减轻肝细胞损伤,C2极显著降低GSTA1 mRNA表达量(p0.01),OL极显著升高GSTA1mRNA表达量(p0.01);蛋白表达情况表明,C2可以下调HNF-1和GSTA1的蛋白表达,OL上调HNF-1和GSTA1的蛋白表达。(3)HNF-1对GSTA1表达调控作用的结果显示,构建的pGSTA1-1298-LUC质粒转染细胞后,当降低HNF-1的蛋白表达时,肝细胞荧光素酶相对活性极显著降低(p0.01);增加HNF-1的蛋白表达时,肝细胞荧光素酶相对活性极显著升高(p0.01),表明HNF-1对GSTA1表达具有调节作用,且GSTA1的表达变化与HNF-1表达变化趋势一致;构建的HRE突变质粒pGSTA1-ΔHNF1-LUC转染细胞后,当HNF-1表达水平升高或降低时,肝细胞荧光素酶活性并无明显变化,证明HNF-1对GSTA1表达调控是通过与其启动子的结合位点HRE作用来实现的。(4)JNK抑制剂,C2和OL对肝细胞损伤作用结果表明,抑制剂组与OL组,转氨酶活性极显著降低(p0.01),HNF-1与GSTA1的mRNA和蛋白表达量极显著升高(p0.01);C2组转氨酶活性极显著升高(p0.01),HNF-1与GSTA1的mRNA和蛋白表达量极显著降低(p0.01);与C2组相比,AP+SP+C2组转氨酶活性极显著降低(p0.01),HNF-1与GSTA1的mRNA和蛋白表达量极显著上升(p0.01);AP+SP+OL组比OL组相比,HNF-1和GSTA1的mRNA和蛋白表达量无显著变化;其他肝细胞指标均呈极显著变化(p0.01)。表明APAP诱导的肝细胞损伤与JNK的活化有关,抑制JNK可以明显提高HNF-1和GSTA1的表达,减轻肝细胞损伤。(5)检测细胞中p-JNK、JNK、JNK下游蛋白p-c-Jun、c-Jun和凋亡相关蛋白Bax和Caspase-3的蛋白表达量,结果显示,抑制剂组与OL组p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun的值以及Bax和Caspase-3的相对表达量均极显著下降(p0.01);C2组极显著上升(p0.01),AP+SP+C2组与C2组相比,p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun的值以及Bax和Caspase-3的相对表达量均极显著下降(p0.01);AP+SP+OL组比OL组,未有明显变化。表明在APAP诱导的肝细胞损伤中,JNK信号通路被激活,JNK磷酸化、其下游蛋白的磷酸化以及凋亡蛋白表达量上升。本研究成功复制APAP诱导的肝细胞损伤模型,GSTA1的表达可以受C2和OL的影响;HNF-1对GSTA1的表达具有调节作用;通过定点突变GSTA1的启动子结合位点HRE,确定HNF-1对GSTA1调控作用是通过与其启动子结合位点HRE作用来实现的。JNK抑制剂作用后,通过基因和蛋白水平,证明了细胞损伤与JNK信号通路有关,JNK信号通路的激活,可以下调HNF-1和GSTA1的表达,加重肝细胞损伤情况;抑制JNK信号通路激活,可以上调HNF-1和GSTA1的表达,减轻肝细胞损伤程度,因此,JNK信号通路与HNF-1和GSTA1均参与药物性肝损伤过程,并在肝细胞损伤中起到重要作用。
【图文】：

引 言NAPQI便与亲核大分子、DNA、蛋白质的巯基基团等替代靶标反应形成加合物[23]，过程中生成大量的ROS等加重了对线粒体的损伤，造成炎症反应的发生，引起氧化应激可激活c-Jun-末端激酶导致肝细胞损伤，最终死亡。APAP过量引起线粒体功能障碍，，氧化应激和细胞凋亡被认为对肝脏毒性的研究和发展起至关重要的作用[24,25]。

：**表示与对照组相比 p<0.01；#表示与模型组相比 p<0.05；##表示与模型组相比 p<0.01图 3-2 C2 处理损伤细胞培养上清 ALT 和 AST 活性变化（ x ±s，n=4）Fig.3-2 The alterations in ALT and AST activities in culture supernatant of injured ctreated with C2 ( x ±s, n=4)：*表示与对照组相比 p<0.05图 3-3 C2 处理正常细胞培养上清 ALT 和 AST 活性变化（ x ±s，n=4）Fig.3-3 The alterations in ALT and AST activities in normal cells culture supernatant twith C2 ( x ±s, n=4)
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S859.7

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本文编号：2626615