禽流感病毒H9N2、H5N1 HA1与鸡IgY Fc片段融合蛋白在昆虫细胞中的表达及免疫试验

发布时间：2020-04-14 23:00

【摘要】：高致病性禽流感H5N1和低致病性禽流感H9N2在全球范围内的广泛传播,加速了新型流感的发生和流感大流行的风险。H9N2和H5N1亚型禽流感病毒常与其他亚型发生广泛的基因重组形成致病力较高的新型病毒,如H7N9、H10N8,并且可以跨越物种障碍直接感染人类,威胁人类健康。因此,对H9N2和H5N1禽流感的预防尤为重要。禽流感病毒主要通过呼吸道、消化道等黏膜部位感染机体。通过鼻腔免疫亚单位疫苗可以引起局部的黏膜免疫反应,从而阻断禽流感病毒原发部位的感染。将抗原完整的跨越黏膜屏障转运是成功诱导黏膜免疫的关键。但是由于黏膜免疫系统的复杂性,抗原的有效转运受到制约。鸡卵黄抗体Ig Y Fc受体(Fc Ry)是鸡Ig Y的转运受体。在本实验室前期研究中,已经证实了Fc Ry可以将Ig Y Fc-融合蛋白跨越黏膜屏障进行转运。在本研究中,将禽流感病毒H9N2和H5N1的主要保护性抗原HA1与鸡Ig Y Fc片段融合,在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中表达,并辅以佐剂Cp G-ODN2007,制备二价亚单位疫苗。通过滴鼻免疫鸡,显示融合蛋白可以借助呼吸道黏膜上皮细胞表达的Fc Ry进行转运跨越黏膜屏障,诱导机体产生了针对H9N2、H5N1禽流感病毒HA1的有效特异性黏膜免疫和全身性免疫应答。主要结果如下:1.H9N2禽流感病毒HA1的表达及鼠抗H9N2 HA1多克隆抗体的制备成功构建p GEX-KG-HA19原核表达载体,并在大肠杆菌BL21中诱导表达GST-HA19融合蛋白,将该融合蛋白纯化后辅以佐剂免疫小鼠,成功制备了鼠抗H9N2HA1的高免血清,利用间接ELISA检测抗体效价高达1:256000,经Western Blot鉴定该多克隆抗体具有良好的特异性。2.构建p FastBac HTb-sHA19-HA15-Fc、p FastBac HTb-sHA19-Fc重组质粒及融合蛋白的表达与鉴定将禽流感病毒H9N2含有信号肽的HA1(sHA1)及H5N1 HA1与鸡IgY Fc片段融合,构建p Fast Bac HTb-sHA19-HA15-Fc真核表达载体;将禽流感病毒H9N2 sHA1与鸡Ig Y Fc片段融合,构建p Fast Bac HTb-sHA19-Fc真核表达载体。然后,利用Bac-to-Bac表达系统分别表达sHA19-HA15-Fc和sHA19-Fc融合蛋白。经SDS-PAGE电泳检测,其蛋白大小约为140KDa、105KDa,比预测蛋白略大。应用Western Blot分别对该融合蛋白的HA19、HA15和Fc片段进行检测,结果显示各蛋白均成功表达。在非还原条件下检测蛋白大小约为280KDa、210KDa,说明该融合蛋白以二聚体的形式存在,具有类似Ig Y的分子结构。3.sHA19-HA15-Fc融合蛋白二价亚单位疫苗对鸡的免疫效果评价将sHA19-HA15-Fc融合蛋白辅以佐剂Cp G-ODN 2007滴鼻免疫鸡,可以同时诱导有效的局部黏膜免疫和全身性免疫应答。(1)二免后第10d,气管和肺脏冲洗液检测中,sHA19-HA15-Fc滴鼻免疫组抗H9N2 HA1和抗H5N1 HA1特异性s Ig A和Ig Y抗体效价均最高,除了sHA19-Fc和sHA15-Fc滴鼻免疫组外,与其他免疫组相比差异极显著(P0.01)。(2)二免后第10d,sHA19-HA15-Fc滴鼻免疫组血清中IFN-γ、IL-2均极显著高于sHA19-HA15滴鼻免疫组和灭活苗组(P0.01),与sHA19-Fc或sHA15-Fc滴鼻免疫组无显著性差异。(3)二免后第10d,sHA19-HA15-Fc滴鼻免疫组脾淋巴细胞增殖指数显著高于sHA19-HA15-Fc皮下免疫组和sHA19-HA15滴鼻免疫组。(4)二免后第14d,sHA19-HA15-Fc滴鼻免疫组血清中抗H9N2 HA1和抗H5N1HA1特异性Ig Y的ELISA抗体和HI抗体水平均为最高,与sHA19-HA15滴鼻免疫组差异极显著(P0.01)。(5)H9N2病毒攻毒后第5天,sHA19-HA15-Fc滴鼻免疫组、sHA19-Fc滴鼻免疫组的咽拭子和泄殖腔拭子均未检测到H9N2病毒的血凝活性,其保护率均为100%,sHA19-HA15-Fc皮下免疫组、灭活苗组攻毒保护率分别为75%、87.5%,而sHA19-HA15滴鼻免疫组保护率仅为25%。该研究结果表明,将sHA19-HA15-Fc融合蛋白辅以黏膜佐剂,滴鼻免疫鸡,可以利用鼻腔黏膜上皮细胞表达的Fc Ry胞转将鸡Ig Y Fc-融合蛋白跨越黏膜屏障进入血液循环,诱导机体产生抗H9N2、H5N1禽流感病毒的有效局部黏膜免疫和全身性免疫应答,完全保护免疫鸡抵抗H9N2禽流感病毒的感染。
【图文】：

示意图,甲型流感病毒,灭活苗,减毒活疫苗

苗的研究进展来，为了控制流感，我国实施了广泛的疫苗接种计划苗主要包括灭活苗、减毒活疫苗、DNA 疫苗、病毒样中，，灭活苗和减毒活疫苗使用最为广泛，在中国至少苗 (Sun and Liu 2015)。然而，禽流感病毒在鸡群中仍的鸡群中也是如此 (Zhang et al 2008)。因此，迫切需流感疫情。减毒活疫苗含有流感病毒的尿囊液通过甲醛灭活制备而成，是目用疫苗的 95.5％ (Swayne 2012)。传统的灭活苗是通使机体获得良好的免疫效力。研究表明，灭活苗主要图 1-1 甲型流感病毒结构的示意图 (Zhang et al 2015)Figure.1-1 Schematic diagram of an influenza A virus virion

结构图,结构图,非人灵长类,受体

Fc 受体 (FcRn) 的研究进展儿 Fc 受体 (FcRn) 作为一种可以使母源 IgG 转入动物的肠上皮细胞中被分离和鉴定 (Jones and W在其他哺乳动物，包括人类、非人灵长类、反刍类达 (Leach et al1996, Mayer et al 2004)。研究表明FcRn，其发挥的作用和转运 IgG 的时间和途径也不新生儿的血液中，FcRn 还参与 IgG 跨越胎盘的胞体内血清 IgG 的平衡 (Leach et al 1996, Ghetie an障的双向转运，介导抗原—抗体复合物的递呈011, Li et al 2011)。 IgG 的转运，首先要使 FcRn 与 IgG 相结合。研究图 1-2 鸡 IgY 结构图 (Rahman et al 2013)Figure. 1-2 Basic structure of IgY
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65

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