褪黑素对脂肪细胞内质网应激诱导炎症的影响及其分子机制研究

发布时间：2020-04-14 23:14

【摘要】：褪黑素作为多功能生物因子,具有多样的调节作用,包括抗氧化、抗炎以及参与免疫调节等,但是关于褪黑素是否通过影响内质网应激对炎症起作用却未知。本试验通过使用衣霉素处理建立3T3-L1脂肪细胞内质网应激模型诱导炎症,再用褪黑素,分别检测了其对内质网应激与炎症不同方面的影响以及作用机制,共获以下结果:1.褪黑素通过上调生物节律从而缓解内质网应激。使用1μmol/L褪黑素(Melatonin,MT)处理成熟的脂肪细胞24h之后,检测发现生物钟基因CLOCK和BMAL1的mRNA表达显著增加(P0.05)、PER1、PER2、CRY1、CRY2和REV-ERB的mRNA表达显著减少(P0.05),内质网应激和炎症相关基因表达也发生了显著的下降;用钙离子探针对脂肪细胞染色后发现,褪黑素处理显著减少钙离子荧光强度从而缓解内质网应激;通过检测PER1在MT处理前后的DNA甲基化水平显示,褪黑素通过下调生物钟基因PER1的DNA甲基化促进生物节律,其中甲基化结合蛋白3(Methyl-CpG-binding domain 3,MBD3)的减少最显著;进一步在细胞中干扰PER1后发现内质网应激关键通路分子ATF6的mRNA水平显著增加(P0.05),使用生物信息学预测发现ATF6启动子区有两个位点可以与PER1的E-box位点相结合,通过荧光素酶活性检测发现干扰PER1基因可以显著增加两个E-box位点的相对荧光活性(P0.05),说明PER1通过负转录调控ATF6缓解内质网应激。2.褪黑素减轻内质网应激介导的炎症反应。为了检测褪黑素对内质网应激介导炎症的现象作用,使用2 ug/mL的衣霉素(tunicamycin,TM)处理细胞12h构建内质网应激的模型,再用褪黑素处理,检测发现内质网应激标志因子ATF6、PERK、IRE1、GRP78、CHOP的mRNA和蛋白表达水平均显著上调(P0.05),炎症相关基因IL-6、TNF-α、NF-κB、NLRP3、IL-1β的mRNA和蛋白表达也显著增加(P0.05),说明了内质网应激成功诱导炎症的发生,而MT处理可以缓解这种作用;此外,使用内质网应激抑制剂4-苯基丁酸(4-PBA)处理,发现当内质网应激被抑制时,炎症相关基因表达显著下调。又通过活体注射20 mg/kg的褪黑素和1μg/g衣霉素,发现内质网应激和炎症相关基因在脂肪组织中的表达发现与细胞水平一致,并且通过对脂肪组织切片进行HE染色,发现内质网应激条件下,炎性浸润现象明显,且ATF6的免疫组化水平显著增加,IL-6、TNF-α、GRP78和ATF6的免疫荧光强度也显著升高,而MT可以抑制这种作用,以上说明MT可以缓解内质网应激介导的炎症反应。3.褪黑素减轻内质网应激诱导M1型巨噬细胞极化介导炎症反应。脂肪细胞炎症与巨噬细胞之间的作用联系密切,本实验使用脂肪细胞与巨噬细胞共培养,分别使用脂多糖(LPS)和白介素-4(IL-4)诱导M1和M2型巨噬细胞的成熟,脂肪细胞中超表达内质网应激关键通路因子ATF6,通过检测M1型巨噬细胞标志基因IL-6、TNF-α、IFN-γ和IL-12以及M2型巨噬细胞标志基因CD163、CD206、IL-10和IL-4的mRNA及蛋白表达,发现脂肪细胞内质网应激条件下M1型巨噬细胞表面标志基因表达显著上调,M2型巨噬细胞表面标志基因表达显著下降;对IFN-γ和CD163的免疫荧光染色发现,脂肪细胞内质网应激可以促进IFN-γ的荧光强度,减弱CD163的荧光表达,而在添加了褪黑素之后,这些现象被逆转。此外,发现超表达ATF6后,炎性小体相关基因NLRP3、Pro-caspase1、Caspase1、Pro-IL-1β和IL-1β的mRNA及蛋白水平也发生了显著的上调(P0.05),使用MT处理之后,作用相反,说明脂肪细胞内质网应激可以通过激活炎性小体表达促进炎症,而MT可以减轻这种作用。以上结果说明了褪黑素缓解内质网应激介导的炎症反应。综上所述,本试验明确了褪黑素在脂肪细胞内质网应激和炎症中的调控作用,即褪黑素通过增加生物钟基因节律表达抑制内质网应激诱导的炎症反应,并且发现DNA甲基化、基因转录调控及巨噬细胞极化等机制参与其中。本研究为治疗脂肪细胞炎症反应提供了新的靶点,为研究动物脂肪沉积的遗传调控提供一定的理论基础。
【图文】：

图 1-1 生物钟的等级组织（A.A.Kondratova.et al.2013）1 A hierarchical organization of the circadian clock（A.A.Kondratova.et因的表达在 SCN 之外的不同脑结构中有节律地振荡，表明研究表明，这些时钟的同步活动对许多心理过程至关重要，对认知功能产生负面影响(Reddy et al.2010; Wulff et al.2010公认的，最近的研究表明，时钟也涉及情绪调节，记忆和对 al.2006)。因的调节机制的机制涉及基因表达，蛋白质修饰和分泌的昼夜节律振荡，产物所控制 (Ko et al.2006)。在单个或多个时钟基因已经被的实验揭示了对运动，行为，生理学和基因表达中的昼夜节物钟基因及其产物在转录-翻译反馈环中连接起来(Sheram.2007)，在钟基因产物中，存在正转录调控因子 BMAL1、CLO节因子 CRY1、CRY2、PER1、PER2 和 Rev-Erb-α，其中，BMA可以特异性的与染色质相互作用并对其进行修饰，，从而上调

基本的螺旋-环-螺旋 (bHLH) 蛋白质是转录因子，可以是制因子，它们具有高度碱性的区域以及螺旋-环-螺旋形态，bHLH 蛋结构域与其他 bHLH 蛋白形成同二聚体或异二聚体，从而使得它们的识别 E-box 序列的 DNA-结合基序。它们通过结合基因启动子区中的从而激活 PER1、PER2 以及 CRY1 和 CRY2 基因的转录。PER / CRY断 BMAL1 / CLOCK 活性来抑制其自身基因的转录 (X.Gu et al.2012)-BMAL1 复 合 物 介 导 的 昼 夜 节 律 输 出 并 且 诱 导 其 他 转 录 因 子ffield et al.2002;K.Oishi et al.2003; A.Grechez et al.2004)。第二个反馈环体 RORa 和 REV-erba 的转录组成的 (P.L.Lowrey et al.2004; S.M.R，该转录过程在白天由 CLOCK / BMAL1 复合物激活，随后它们通过中的 Rev-erba / RORa 应答元件对 BMAL1 基因施加正向和负向rey et al.2004; S.M.Reppert et al.2002)。昼夜节律系统通过时钟控制的周期基因影响其他生理过程(X Yang et al.2010;I.Schmutz et al.201S.Gery et al.2006)。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.3

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本文编号：2627824