重组Griffithsin蛋白的表达及抗猪流行性腹泻病毒的活性研究

发布时间：2020-04-16 08:35

【摘要】：研究背景:由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的猪流行性腹泻(PED)疾病给广大的猪养殖者们造成了严重的经济损失。由于PEDV具有较高的变异性等原因,目前市场上的弱毒苗和灭毒苗无法完全满足有效性和安全性的要求。故,迫切需要研发新型的PEDV疫苗,或者抗病毒药物用于防治PED。格瑞弗森(Griffithsin,GRFT)蛋白是从红藻Griffithsia sp.中提取的对冠状病毒具有广谱抗性的凝集素。该凝集素通过直接结合病毒囊膜蛋白上的糖链,抑制其与宿主细胞受体结合,从而使病毒失活。因冠状病毒囊膜蛋白上的糖链一般较为保守,所以GRFT蛋白的抗病毒效果不受病毒囊膜上氨基酸易变异的影响,从而有望克服因病毒氨基酸变异所引起的变异毒株问题。研究目的:本文尝试检测GRFT蛋白抗PEDV感染的活性,为PED的防治提供新的思路。研究内容:根据GRFT蛋白序列推测其基因序列并合成双链DNA,构建重组表达载体pET28a-SUMO-GRFT,诱导表达并纯化重组GRFT;然后,通过GRFT蛋白与PEDV孵育,研究GRFT蛋白对PEDV感染Vero细胞的抑制效果,并测定其抑制病毒感染的有效作用剂量;为进一步探究GRFT对PEDV的作用靶点,采用PNGase F处理PEDV;最后,本文对GRFT蛋白抗病毒活性在加热、酸浴、胰蛋白酶消化处理、胃蛋白酶消化处理以及存储条件等方面受到的影响进行了初步评估。研究方法:蛋白的表达与纯化,SDS-PAGE,免疫印记实验,细胞空斑实验。研究结果:原核表达的重组GRFT蛋白对PEDV感染具有良好的抑制效果,可以作为抗PEDV感染的候选药物。使用原核表达的重组GRFT蛋白处理PEDV后感染Vero细胞,实验结果表明,重组GRFT蛋白可以显著抑制PEDV对Vero细胞的感染,而且该蛋白的抗感染效果呈剂量依赖性,1μM重组GRFT蛋白的相对空斑抑制率为95.8%,达到50%相对空斑抑制率所需的GRFT蛋白浓度为39.22 nM。GRFT蛋白稳定性实验结果:本文表达的重组GRFT蛋白具有良好的热耐受性、酸耐受性以及一定的胃蛋白酶耐受性。GRFT蛋白的存储实验表明,重组GRFT蛋白可以在4℃环境中保存至少六个月,在室温(25℃)环境中至少可以保存3个月。研究意义:本文首次证明了重组GRFT蛋白对PEDV具有较好的抗感染效果,为PED的防治提供新的思路。
【图文】：

结构模式,病毒粒子,纤突蛋白,囊膜蛋白

图 1.1 PEDV 病毒粒子结构模式图[3]Fig. 1.1 PEDV virus structure结构股正链 RNA 病毒，遗产物质大小约 28 Kb。研究常的 3’和 5’端非编码区以外，还至少包含 7是：ORF1a、ORF1b、ORF3、S、E、M、N[3, 复制酶多聚蛋白 1 a、1 b 和 ORF3 辅助蛋白 3 纤突蛋白( Spike protein)、囊膜蛋白( Envelop及核衣壳蛋白( Nucleocapsid protein)4 种结构蛋

双酶,电泳分析,诱导表达,上清液

pET28a-SUMO-GRFT 的双酶e identification of pET28a-SU0；2：pET28a-SUMO-GRFT ble enzyme cutting results of pEMO-GRFT 的诱导表达与oli BL21（DE3）中，利用取离心上清液纯化蛋白。PAGE 电泳分析，，实验结果了较强的目的条带，且条筛选的重组菌成功表达了
【学位授予单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.651

【参考文献】