化脓隐秘杆菌Fim A、C和E表达情况的鉴定与Fim E单克隆抗体的制备

发布时间：2020-04-16 13:30

【摘要】：化脓隐秘杆菌(Trueperella pyogenes,T.pyogenes)是一种共生菌,主要寄生在家畜及野生动物的呼吸道、消化道和生殖道等黏膜处;同时也是一种条件性致病菌,可引起多种动物不同组织的炎症。已有研究表明,T.pyogenes具有菌毛结构,但对其菌毛的结构和功能的研究极少。菌毛作为细菌的毒力因子之一,在细菌入侵宿主的过程中发挥重要作用。因此,对T.pyogenes的菌毛进行深入研究对于全面揭示T.pyogenes的致病机制和指导T.pyogenes疫苗的开发具有积极意义。本研究克隆了T.pyogenes的三种菌毛蛋白(Fimbrial Subunit Protein,Fim)的编码基因——fim A、fim C和fim E;制备了三种重组菌毛蛋白(recombinant Fim,rFim)——rFim A、rFim C和rFim E;并分别用三种重组蛋白制备了兔多克隆抗体。应用三种多克隆抗体进行检测,我们证实只有Fim E在培养的T.pyogenes中表达。Western blot结果显示,在pH为7.5的培养环境中培养6~10 h,T.pyogenes中Fim E的表达水平达到最高;Fim E的表达不受厌氧条件的影响,但被微需氧条件抑制。试管凝集试验表明,抗rFim E多克隆抗体能引起细菌发生强烈的凝集反应,说明Fim E表达在T.pyogenes菌体表面。抗rFim C多克隆抗体能引起强烈的凝集反应,但western blot结果显示非特异性反应,因此,用现有方法难以确定T.pyogenes中Fim C是否表达。抗rFim A多克隆抗体不能引起T.pyogenes的凝集,westernblot结果显示非特异性反应,表明在本研究的培养条件下Fim A在T.pyogenes中不表达或表达不良。为了对Fim E蛋白进行深入研究,本研究制备了三株能分泌Fim E单克隆抗体(monoclonal antibodies,mAbs)的杂交瘤细胞,分别命名为2E6、16F7和3A5,并制备了含有高浓度mAbs的腹水。Western blot结果表明,三种抗Fim EmAbs都可以与rFim E发生特异性反应,并能够与T.pyogenes菌体裂解物中一种分子量约为58 kDa的蛋白发生反应。在T.pyogenes菌体裂解物中检测到的成分,其分子量与推测的天然Fim E蛋白的分子量相符。Dot-ELISA实验结果显示,三种mAbs只与T.pyogenes菌体裂解物反应,与T.pyogenes培养上清和大肠杆菌裂解物不发生反应。上述结果表明,制备的mAbs能够与T.pyogenes的Fim E发生相对特异的结合。对三种mAbs的反应特性进行进一步分析,筛选出Fim E蛋白的两个抗原表位区,分别位于Fim E的189-277 aa和438-511 aa区域。综上,本研究证实了培养的T.pyogenes中,Fim E能够较为稳定的表达,并制备了抗Fim E的mAbs,为后续深入探讨T.pyogenes的菌毛结构及功能,提供了一定的理论依据和物质基础。
【图文】：

示意图,表面蛋白,基序,信号肽

兰氏阳性细菌的菌毛由多个单体菌毛蛋白组装而成，菌毛蛋白基因的基因簇酶家族转肽酶的基因，细胞壁表面共价结合的表面蛋白是分选酶家族中用于催化其锚定的结果[51]。期研究测定了革兰氏阳性菌中无乳链球菌[51]（Streptococcus agalactiae），酿reptococcus pyogenes）的菌毛相关结构，，后来在研究分选酶介导的菌毛装配一些金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎链球菌（Streptococcus pneu棒状杆菌（Corynebacterium diphtheriae）等革兰氏阳性菌的菌毛结构，这些结构有一些共同的特征（如都具有分选信号 LPXTG 等部分保守结构）[53,54]。研究对 T. pyogenes 的菌毛蛋白基因进行了相关的研究，类似于其他革兰氏阳 pyogenes 菌毛蛋白的基因与编码菌毛组装和功能所需的蛋白质的基因聚集在结构来看，这些菌毛蛋白带有信号肽和 LPXTG 分选信号。菌毛蛋白多肽链后，N 端信号肽指导表面蛋白通过分泌系统运出胞外并被信号肽酶切除。分蛋白 C 端的分选基序 LPXTG，并在 T-G 切割肽键[55,56]，切割后的多肽的末位于邻接的同类型菌毛蛋白的 N 末端的菌毛蛋白基序内的保守赖氨酸上，转环菌毛聚合物共价连接到细胞壁的肽聚糖上，形成交联聚合物（图 1-1）。最将目标蛋白共价连接至细胞壁[57]。

白喉杆菌,菌毛,修正模型

注：A 菌毛聚合过程；B 菌毛聚合物的细胞壁锚定过程；C SpaB 穿插在菌毛中的过程。图 1-2 白喉杆菌菌毛组装的修正模型[61]Fig. 1-2 The revised model of pilus assembly in C. diphtheriae[61]究的目的和意义pyogenes 能引起多种经济型家畜和野生保护动物疾病并造成一定经济损失，因机制和毒力因子并依此开发新型防控手段有一定积极意义。研究拟利用原核表达的重组 T. pyogenes 菌毛蛋白免疫动物，制备相应的多克隆，并利用制备的抗体检测相应的菌毛蛋白在 T. pyogenes 纯培养物中的表达情为深入探讨 T. pyogenes 的致病机制提供部分理论依据和物质基础。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.61

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