新城疫病毒微型基因组的构建及M、V、W蛋白对病毒复制与转录调控的研究

发布时间：2021-03-19 20:02

新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)为单股负链不分节段的RNA病毒,由于其基因组较大,约15 kb,直接在全长基因组中进行分子操作存在技术困难,对NDV复制转录的机制及相关蛋白功能的研究会产生巨大障碍。故采用微型基因组(Minigenome)技术,即用报告基因替代病毒编码区,只保留与病毒基因复制和转录相关的基本调控序列。NDV基因组的复制和转录依赖于RNP复合物的NP、P和L三种蛋白,其它的病毒蛋白可能会与RNP复合物发生相互作用,而其是否参与调控病毒复制和转录所知甚少。本研究设计了四种微型基因组方案,通过对不同方案进行验证,明确了微型基因组构建过程所需要的序列信息及插入方式,同时比较了在不同启动子下表达效率的差异。此外,对基础微型基因组平台进行特殊改造,创建了复制缺陷型微型基因组,并对M、V及W蛋白对病毒复制与转录过程的影响进行了初步研究。主要的研究结果如下:1.四种NDV微型基因组的构建。设计方案:(1)按照模拟病毒基因组的方式,将报告基因EGFP反向插入,两侧分别为5’Trailer与3’Leader的调控序列,命名为Mini;(2)在Mini基础上,缺失相应的GE、GS及UTR序列,命名为Mini2;(3)按照构建感染性克隆的方式,将EGFP正向插入,两侧分别为5’Leader与3’Trailer的调控序列,命名为MG;(4)在MG基础上,缺失相应的GE、GS及UTR序列,命名为MG2。四种微型基因组分别克隆在含T7启动子的pUC19载体中,与NP、P、L及T7 RNA聚合酶表达质粒共转染BHK-21细胞分析EGFP的表达,发现仅Mini具有功能性。结果表明报告基因只能反向插入,GE-5’UTR、3’UTR-GS是微型基因组必不可少的基因元件。2.两种启动子对微型基因组表达效率的影响。将Mini微型基因组分别克隆到含T7启动子与鸡β-actin启动子的载体中,分别为pUC19-Mini-EGFP与pCAGGS-Mini-EGFP。通过对表达效率的分析,结果发现T7启动子远高于鸡β-actin启动子。3.复制缺陷型微型基因组的构建。为了独立研究病毒的复制与转录两个过程,将微型基因组5’端Trailer序列缺失,导致病毒基因组(vRNA)复制产生3’端缺失Trailer(ΔT)的cRNA,ΔT cRNA将不能启动复制产生vRNA,以此可以区分基因的复制与转录过程,命名为pUC19-Mini-ΔT。4.M、V和W蛋白对病毒复制和转录调控的作用。为了定量报分析报告基因的表达,在正常(复制敏感型)与复制缺陷型的两种微型基因组中采用萤火虫荧光素酶报告基因,分别命名为pUC19-Mini-Lu和pUC19-Mini-ΔT-Luc。将M、V和W表达质粒与两个系统分别共转染细胞,分析萤火虫荧光素酶活性,结果显示仅V蛋白对病毒基因组的转录有抑制的作用,而M和W蛋白没有影响。综上所述,明确了微型基因组的构建方式,并对微型基因组的表达进行了的优化。同时利用正常与复制缺陷型的两种微型基因组,确定了V蛋白对病毒的转录有影响。本研究为了解NDV基因组的复制与转录及相关蛋白的作用奠定了基础。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.65

文章目录

摘要

ABSTRACT

文献综述

第一章新城疫病毒及微型基因组系统的研究进展

1.1 新城疫病毒概述

1.1.1 NDV的分子结构及蛋白功能

1.1.2 NDV复制与转录的过程

1.2 M、V及W蛋白对病毒复制和转录的调控

1.3 NDV的微型基因组

1.3.1 微型基因组

1.3.2 微型基因组的构造

1.3.3 微型基因组的表达

1.3.4 微型基因组的应用

试验研究

第二章新城疫病毒微型基因组的构建

2.1 材料

2.1.1 细胞、载体及毒株

2.1.2 主要试剂、主要仪器及常用试剂的配制

2.2 方法

2.2.1 不含报告基因微型基因组的合成

2.2.2 引物的设计及合成

2.2.3 质粒的构建

2.2.4 病毒总RNA的提取与反转录

2.2.5 Western Blot

2.2.6 荧光蛋白的观察

2.3 结果

2.3.1 微型基因组的设计

2.3.2 微型基因组质粒的构建

2.3.3 不同启动子微型基因组质粒的构建

2.3.4 辅助质粒的构建

2.3.5 表达T7 RNA聚合酶质粒的构建及验证

2.3.6 微型基因组功能的分析

2.4 讨论

2.5 小结

第三章利用微型基因组系统研究M、V及W蛋白对NDV复转与转录调控的作用

3.1 材料

3.1.1 细胞及载体

3.1.2 主要试剂、主要仪器及常用试剂的配制

3.2 方法

3.2.1 引物的设计与合成

3.2.2 质粒的构建

3.2.3 荧光素酶的测定

3.3 结果

3.3.1 含荧光素酶报告基因微型基因组的构建

3.3.2 复制缺陷型微型基因组质粒的构建

3.3.3 M、V及W蛋白对病毒复制与转录的影响

3.4 讨论

3.5 小结

结论

参考文献

附录

致谢

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