粪类圆线虫RIOK-2蛋白激酶编码基因的结构与功能研究

发布时间：2020-04-19 15:58

【摘要】：寄生线虫不仅给养殖业造成严重的经济损失,而且还可以感染人,严重影响人类的健康。WHO组织评估全球有超过10亿人口感染寄生线虫,在伤残调整生命年中,寄生线虫的影响超过了糖尿病和肺癌患者。大规模和长期抗寄生虫药物的使用已经诱导出寄生虫抗药性的产生,因此新药的开发迫在眉睫,而新型抗寄生线虫药物以及疫苗的研发需要对寄生线虫发育过程中关键基因的功能进行深入研究。蛋白激酶在寄生线虫发育生物学和生殖发育学等过程中发挥着重要作用,以蛋白激酶作为药物靶标治疗疾病的研究已有报道,但在寄生线虫中的研究还寥寥无几。RIOK-2蛋白激酶是一种新发现的非典型蛋白激酶,在酵母和人细胞核糖体生物合成、细胞周期调节等过程中发挥着重要作用。尽管如此,该分子在线虫中的功能还所知甚少。本项目选取人兽共患寄生线虫粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)作为研究对象,从结构和功能两方面对粪类圆线虫RIOK-2蛋白激酶编码基因Ss-riok-2进行了研究;同时利用模式生物自由生活的秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的转基因和RNAi技术研究了Ce-RIOK-2蛋白激酶编码基因Ce-riok-2的功能。(一)粪类圆线虫Ss-RIOK-2蛋白激酶编码基因的结构分析本研究通过RACE-PCR获得了Ss-riok-2基因的c DNA序列,其中编码区为1572bp,共编码523个氨基酸。通过氨基酸比对发现编码的Ss-RIOK-2蛋白具有保守的功能结构域。利用生物信息学软件对Ss-RIOK-2蛋白三级结构进行同源建模,预测了Ss-RIOK-2蛋白与ATP、金属离子结合的关键活性位点,为开发以RIOK-2蛋白作为潜在的抗寄生虫药物靶标奠定理论基础。通过Genomewalker PCR获得Ss-riok-2基因的g DNA,其长度为1620bp,包含一个48bp的内含子。预测的Ss-riok-2基因启动子序列全长1308bp,含有真核生物保守的调控元件。(二)粪类圆线虫Ss-RIOK-2蛋白激酶编码基因的表达、转录水平及定位分析体外原核表达和纯化了Ss-RIOK-2融合蛋白,进一步的激酶活性实验验证了Ss-RIOK-2蛋白激酶具有自我磷酸化作用。通过转录组分析,Ss-riok-2基因在虫体各个阶段都有转录且在寄生雌虫中最高。转基因实验表明Ss-riok-2基因启动子可以驱动gfp基因表达在F1代幼虫的肠道组织。(三)秀丽隐杆线虫Ce-RIOK-2蛋白激酶编码基因的功能分析预测的Ce-riok-2基因启动子序列全长1269bp,转基因实验表明Ce-riok-2基因启动子也可以驱动gfp基因表达在F1代幼虫的肠道组织。当幼虫进入deaur时期时表达减弱。反转录PCR检测到Ce-riok-2基因在性腺组织中也有转录。通过ds RNA饲喂法干扰Ce-riok-2基因在秀丽隐杆线虫中的表达,结果导致Ce-riok-2基因转录水平下调,同时引起Ce-vit-2基因转录水平上调且导致虫体发生以下表型变化:1.虫体的发育减慢;2.虫体不育;3.虫体的阴门突出;4.成虫的性腺细胞减少和细胞大小紊乱。本研究首次研究了寄生线虫粪类圆线虫Ss-RIOK-2蛋白激酶编码基因Ss-riok-2基因的结构和功能,并验证了自由生活线虫秀丽隐杆线虫Ce-RIOK-2蛋白激酶的功能。以上结果为进一步阐明RIOK蛋白激酶在秀丽隐杆线虫、粪类圆线虫及相关寄生线虫生长发育过程中的分子生物学功能奠定了基础。
【图文】：

粪类圆线虫,生活史

是 1876 年 Normand 从一名患有腹泻疾病的996)。粪类圆线虫属于杆形目(Rhabditata)、类圆ides) 线虫(林海和杨光友 2016)。粪类圆线虫的，自由生活雌虫的体长约 900-1700 μm，寄生rove 1996, 牟海燕等 2001)。粪类圆线虫可以寄的小肠粘膜内引起粪类圆线虫病，严重者会导为“被忽视的热带病”(Olsen et al 2009)，尤其染，导致粪类圆线虫大量繁殖，严重危害人类虫的生活史trongyloides stercoralis)的生活史较其他寄生线虫生活史，包括宿主体内的寄生循环(the Parasitthe Free-living cycle)。寄生生活中只有雌虫，自

粪类圆线虫,发病机理

图 1-3 我国粪类圆线虫的感染病例分布(Wang et al 2013Fig. 1-3 Cumulative cases and distribution of strongyloidiasis in(Wang et al 2013)圆线虫的发病机理及临床表现线虫感染是我国常见的蠕虫类寄生虫病之一，主要发病机理向小肠移行引起疾病。粪类圆线虫病可引起胃肠道症状,包括，皮肤问题包括瘙痒、皮炎和呼吸道症状,如咳嗽、呼吸 al 2002, Keiser and Nutman 2004, 李松林 2001)。当患者的如患有 T 细胞淋巴型病毒病、肾脏移植病、艾滋病等恶性类圆线虫病，往往会影响多个宿主器官，严重时可导致死亡ing and Weiss 2006, Sarangarajan et al 1997)。慢性无症状类圆感染(Grove 1996)，当同时应用免疫抑制治疗时，它又极有重度感染(Keiser et al 2004)。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.731

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