硫酸黏菌素单克隆抗体的研制及ELISA检测方法的建立

发布时间：2020-04-19 17:46

【摘要】：硫酸黏菌素(Colistin Sulfate,CLS),又名多黏菌素E(Polymyxin E)、黏杆菌素,是由多黏类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)产生的多肽类抗生素,主要用于敏感菌的防治,也曾被作为生长促进剂在畜禽饲料中广泛使用。由于CLS具有肾毒和神经毒等毒性,人体长期摄入CLS残留超标的食物,极易对健康造成严重的影响。目前,我国农业部已禁止将CLS作为动物生长促进剂使用。为防止CLS的滥用和非法添加,需采用有效的检测方法对动物性食品中CLS的残留进行监控。目前,针对CLS残留建立的检测方法包括微生物法、液相色谱法、液相色谱串联质谱法、气相色谱串联质谱法、毛细管色谱法等,这些方法所需要的仪器设备均比较昂贵,且操作方法繁琐、费时,并要求检测人员必须具备专业的实验技术。因此,迫切需要建立针对CLS检测的快速、简便、灵敏度高的方法。本研究通过单克隆抗体制备技术及酶联免疫吸附技术,建立了针对动物性食品中CLS检测的ELISA方法,该检测方法操作简单且灵敏度高,适合畜牧养殖和动物产品加工中的快速检测。1、CLS完全抗原的合成与鉴定CLS是小分子多肽物质,属于半抗原,不具备免疫原性。试验采用异型双功能交联剂3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯(3-Maleimidobenzoicacid-N-hydroxysuccinimide ester,MBS)将CLS分子中的活性氨基(-NH2)与二硫苏糖醇还原BSA二硫键后引入的巯基(-SH)进行偶联,使CLS分子与载体蛋白之间形成一间隔臂,合成了 CLS-BSA免疫抗原。采用戊二醛两步法将CLS的-NH2与载体蛋白OVA的-NH2进行偶联,合成了CLS-OVA包被抗原。通过SDS-PAGE、紫外扫描和免疫学方法对合成完全抗原进行了鉴定,结果确定CLS与载体蛋白偶联成功。使用BCA蛋白检测试剂盒测得CLS-BSA和CLS-OVA 的蛋白浓度分别为 1.8mg/mL、4.6mg/mL。2、CLS单克隆抗体的制备利用完全抗原CLS-BSA以常规免疫程序免疫BALB/c小鼠,五次免疫后测得免疫小鼠血清效价为1:12800以上。利用杂交瘤细胞技术将免疫鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合后,采用ELISA方法和梯度稀释法对融合细胞进效价检测和筛选,获得了 3株能稳定分泌抗CLS单克隆抗体的杂交瘤细胞株3A2、5E2、9G7。采用小鼠体内诱生法分别制得腹水 7 mL、14.7 mL、12.4 mL,其蛋白浓度分别为 14.32 mg/mL、32.57 mg/mL、21.8 mg/mL。抗体经鉴定亚型为IgM,轻链为κ链。通过ELISA法对抗体效价进行检测,均可达到1:12800以上,且与杆菌肽、莫能霉素钠、盐酸万古霉素均无明显的交叉反应,抗体特异性较好。3、CiELISA检测方法的建立利用5E2腹水建立方阵ELISA试验确定检测抗原的最佳工作浓度为1:5000,抗体的工作浓度为1:3200,最佳封闭液为0.5%明胶,以此建立检测CLS的间接竞争ELISA方法。当CLS的添加浓度在10～1000ng/mL范围时,标准曲线线性关系良好,线性方程为y=0.4441x—0.3691(R2=0.9925),其 IC50 为 89.57 ng/mL,LOD 为 9.66 ng/mL,LOQ 为25.71 ng/mL。4、猪肉中CLS添加回收实验利用猪肉样品作为基质进行CLS的添加回收实验,将酸化处理后的猪肉样品做8倍稀释后,即可基本消除样品基质的干扰。当CLS浓度在20～1000ng/mL范围时线性关系良好,线性方程为 y=0.4661x-0.4432(R2=0.9903)。添加 50、500、1000ng/mL 的 CLS回收率在78.66～104.02%之间,变异系数在3.25～6.86%之间。
【图文】：

标准曲线,包被,偶联反应,鸡卵清白蛋白

Ｃ：硫酸黏菌素；Ｏ：鸡卵清白蛋白；ＧＡ：戊＿＾？酸。逡逑：偶联反应３０邋ｍｉｎ的监测；ｂ：偶联反应ｌｈ的监测；ｃ：偶联反应１．５邋ｈ的监测。逡逑图２４邋ＴＬＣ法对包被原合成的监测逡逑Ｃ：邋Ｃｏｌｉｓｔｉｎ邋Ｓｕｌｆａｔｅ；邋Ｏ：邋Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ；邋ＧＡ：邋Ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ．逡逑ｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃｏｕｐｌｉｎｇ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｆｏｒ邋３０邋ｍｉｎｕｔｅｓ；邋ｂ：邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃｏｕｐｌｉｎｇ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｆｏｒ邋１Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃｏｕｐｌｉｎｇ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｆｏｒ邋１．５邋ｈｏｕｒｓ．逡逑Ｆｉｇ．２－４邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃｏａｔｉｎｇ邋ａｎｔｉｇｅｎ邋ｂｙ邋ＴＬＣ邋ｍｅｔｈｏｄ逡逑抗原蛋白浓度的测定结果逡逑ＣＡ法捡测蛋白浓度，以测得的ＯＤ５６２ｎｍ值为横坐标，以标准蛋白浓度为准蛋白数据绘制标准曲线如图２－５。根据标准曲线，，将测得的待测样品，计算出ＣＬＳ－ＢＳＡ的蛋白浓度为１．８邋ｍｇ／ｘｎＬ，ＣＬＳ－ＯＶＡ的蛋白浓度为４．６邋０．６逡逑ｙ邋＝邋０．９７１ｘ－０．１０１２逡逑°＇５逦Ｒ２＝邋０．９９９１逡逑。４逡逑

标准曲线,标准曲线,偶联反应,鸡卵清白蛋白

Ｃ：硫酸黏菌素；Ｏ：鸡卵清白蛋白；ＧＡ：戊＿＾？酸。逡逑ａ：偶联反应３０邋ｍｉｎ的监测；ｂ：偶联反应ｌｈ的监测；ｃ：偶联反应１．５邋ｈ的监测。逡逑图２４邋ＴＬＣ法对包被原合成的监测逡逑Ｃ：邋Ｃｏｌｉｓｔｉｎ邋Ｓｕｌｆａｔｅ；邋Ｏ：邋Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ；邋ＧＡ：邋Ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ．逡逑ａ：邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃｏｕｐｌｉｎｇ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｆｏｒ邋３０邋ｍｉｎｕｔｅｓ；邋ｂ：邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃｏｕｐｌｉｎｇ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｆｏｒ邋１邋ｈｏｕｒ；邋ｃ：逡逑Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃｏｕｐｌｉｎｇ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｆｏｒ邋１．５邋ｈｏｕｒｓ．逡逑Ｆｉｇ．２－４邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃｏａｔｉｎｇ邋ａｎｔｉｇｅｎ邋ｂｙ邋ＴＬＣ邋ｍｅｔｈｏｄ逡逑２．２完全抗原蛋白浓度的测定结果逡逑利用ＢＣＡ法捡测蛋白浓度，以测得的ＯＤ５６２ｎｍ值为横坐标，以标准蛋白浓度为纵坐标，逡逑将测得的标准蛋白数据绘制标准曲线如图２－５。根据标准曲线，将测得的待测样品ＯＤ５６２邋ｎｍ逡逑值代入公式，计算出ＣＬＳ－ＢＳＡ的蛋白浓度为１．８邋ｍｇ／ｘｎＬ，ＣＬＳ－ＯＶＡ的蛋白浓度为４．６邋ｍｇ／ｍＬ。逡逑０．６逡逑ｙ邋＝邋０．９７１ｘ－０．１０１２逡逑°＇５逦Ｒ２＝邋０．９９９１逡逑４。４逡逑Ｊ邋０３邋－逡逑Ｔｋ邋０．２邋－逦ｊＴ逡逑妄。１逡逑０邋－Ｉ逦￣．逦．逦．逦１逦１逦．逡逑０逦０．１逦０．２逦０．３逦０．４逦０．５逦０．６逦０．７逡逑吸光度值Ｕｓ６２）逡逑图２－５邋ＢＣＡ法检测蛋白浓度标准曲线逡逑Ｆｉｇ．
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S859.84

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