粉防己碱对耐喹诺酮类药大肠杆菌耐药逆转作用及其机制的研究

发布时间：2020-04-19 17:24

【摘要】：抗生素和其他抗菌药物的发展降低了各种动物的发病率和死亡率,也增加了人类寿命。随着抗生素在动物中的广泛使用,细菌对喹诺酮类药物的耐药性也日趋严重,特别是大肠杆菌对喹诺酮类药物的耐药率呈逐年增加的趋势。大肠杆菌(Escherichia coli)是危害畜禽甚至人类健康最常见的致病菌之一,因其复杂的抗原性,多样的血清型、易变且多变的临床症状和病理变化,并且易与病毒性疾病和其它细菌性疾病并发,给畜牧业养殖带来经济损失,防治E.coli感染己成为一个世界难题。本试验通过结合前期实验室的研究,选择粉防己碱进行研究。首先,研究其是否对喹诺酮类药物耐药的大肠杆菌有耐药逆转作用;其次,研究粉防己碱对耐喹诺酮类药大肠杆菌耐药基因的影响;同时,研究粉防己碱对大肠杆菌外膜的通透性的影响;最后,通过对耐药菌逆转机制的初步探究,为开发粉防己碱作为耐喹诺酮类药物大肠杆菌的耐药逆转剂研制提供理论依据。1、粉防己碱对临床分离耐喹诺酮类药大肠杆菌的耐药性逆转作用参照CLSI2013方法,采用微量肉汤稀释法测定环丙沙星、恩诺沙星、粉防己碱对实验室的大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC);使用含1/2×MIC浓度喹诺酮类药营养肉汤、1/2×MIC浓度粉防己碱营养肉汤、1/2×MIC浓度喹诺酮类药联合1/2MIC×浓度粉防己碱营养肉汤、营养肉汤对大肠杆菌进行杀菌试验,绘制时间-杀菌曲线;结果:从试验的时间-杀菌曲线结果看,1/2×MIC浓度的粉防己碱对大肠杆菌的抑菌效果微弱,但和1/2×MIC浓度的环丙沙星、1/2×MIC浓度的恩诺沙星联合后可以降低喹诺酮类药物对耐药菌的MIC,提高耐药菌的敏感性。结论:粉防己碱具有增强喹诺酮类药物乳酸环丙沙星、恩诺沙星对耐喹诺酮类大肠杆菌的杀灭作用。2、粉防己碱处理临床分离的耐药大肠杆菌用1/4×MIC浓度的粉防己碱培养耐药大肠杆菌,以获得对粉防己碱耐药性稳定的大肠杆菌菌株,最后用喹诺酮类药物测定粉防己碱处理后肠杆菌的MIC。将上面分组的细菌用1/4×MIC TET浓度的肉汤培养,获得性状稳定的大肠杆菌。同时,用空白肉汤培养组做阴性对照。结果:空白肉汤培养后喹诺酮类对大肠杆菌的MIC没有变化;粉防己碱对培养后的大肠杆菌12-2、16-1、46-1-2、77-1、19-2-1、3-1-3的MIC值均降低,分别降低32、20、32、16、32、20倍。恩诺沙星对培养后的大肠杆菌12-2、16-1、46-1-2、77-1、19-2-1、3-1-3的MIC值均降低,分别降低10、4、40、40、2、1.25倍。结论:粉防己碱联合喹诺酮类药使用时可以增加抗菌药的杀菌作用,降低耐喹诺酮类药大肠杆菌对恩诺沙星的耐药性,粉防己碱有逆转耐喹诺酮类药大肠杆菌耐药性的作用。3、粉防己碱对大肠杆菌耐喹诺酮类药的基因的影响用临床耐药大肠杆菌用1/4×MIC浓度粉防己碱培养后作为研究对象,比较粉防己碱培养前后大肠杆菌的喹诺酮类药物耐药基因aac(6’)-Ib-cr、oqx AB、qnr A、qep A存在情况,及aac(6’)-Ib-cr、oqx AB m RNA的表达量。结果:在粉防己碱培养后大肠杆菌46-1-2耐耐喹诺酮类药基因aac(6’)-Ib-cr、oqx AB丢失,大肠杆菌77-1耐耐喹诺酮类药基因oqx AB丢失;在粉防己碱培养后耐喹诺酮类药大肠杆菌12-2的耐药基因aac(6’)-Ib-cr m RNA的表达量降低。结论:粉防己碱对耐喹诺酮类药大肠杆菌耐药逆转作用机制与降低耐喹诺酮类药基因aac(6’)-Ib-cr m RNA的表达量有关。4、粉防己碱对大肠杆菌外膜通透性的影响以粉防己碱加入前后大肠杆菌作为研究对象,粉防己碱的PBS液处理大肠杆菌,另一组加入PBS液做阴性对照;再加入头孢硝噻吩,用酶标仪检测测荧光随时间的变化。比较加入粉防己碱的大肠杆菌外膜通透性变化情况。结果:加入粉防己碱处理的大肠杆菌和阴性对照相比,在490nm处的吸光度荧光随时间的增加更多。结论:粉防己碱对耐药大肠杆菌外膜通透性有一定影响,并且会在一定程度上增加大肠杆菌外膜的通透性,但对本试验中的细菌对喹诺酮类药的耐药性无影响。
【图文】：

化培养箱中培养。③并分别在 0、1、2、3、4h 时吸取培养物 1mL，加入灭菌生理盐水进行 1倍稀释（x=1，2，3，4......），经过多次稀释后吸取 100μL 均匀涂抹于计数琼脂平皿中。通过预实验确定不同时间点菌液的稀释倍数，使培养后计数平皿的细菌菌落个数于 40～200 之间。④统计不同时间点的菌落数，以培养时间为横坐标，细菌菌浓度为纵坐标绘制营养肉汤、乳酸环丙沙星、粉防己碱、及乳酸环丙沙星联合粉防己碱对大肠杆菌的时间-杀菌曲线,每次做 3 组平行试验。3.1.2.4 结果绘制的不同浓度药物及联合使用时对耐药大肠杆菌的影响与时间的关系曲线，如图 3-1-1 至 3-1-6。由本次试验的时间-杀菌曲线可见大肠杆菌在营养肉中正常生长；在 1/2×MIC 浓度的环丙沙星、1/2×MIC 浓度的粉防己碱对大肠杆菌没有明显的抑制作用；在 1/2×MIC 浓度的环丙沙星下，，加了 160 μg/mL 的防己碱肉汤中耐药菌的生长受到明显抑制。

图 3-1-2 粉防己碱联合环丙沙星对大肠杆菌 19-2-1 的时间-杀菌曲线Fig3-1-2 Time kill kinetics curves of E.coli(19-2-1) for CIP with and without tetrandrine
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S853.74

【参考文献】

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本文编号：2633547