非洲猪瘟病毒无标签重组p54、B602L抗原的制备与应用

发布时间：2020-04-20 03:24

【摘要】：非洲猪瘟(African swine fever,ASF)血清学诊断方法主要有免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫转印试验,其中ELISA抗体检测方法有世界动物卫生组织(OIE)推荐的ELISA方法和商品化ELISA试剂盒,前者以病毒感染细胞提取抗原为检测抗原,只能在ASF参考实验室进行;后者供应量和检测敏感性均不能满足实际需要。非洲猪瘟病毒(ASFV)p54和B602L编码蛋白是强免疫原性抗原,尽管重组p54和B602L抗原国内已有报道,但均带组氨酸标签,不仅需用价格较贵镍亲和柱纯化,而且与带组氨酸标签重组亚单位疫苗免疫猪血清有交叉反应。本研究分别将ASFV p54和B602L与类弹性蛋白多肽(ELP)进行融合表达,用烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶活性包涵体切除ELP标签,旨在简化重组抗原制备工艺和避免融合标签引起的交叉反应。首先以不同融合方向分别将ASFV p54和B602L基因克隆入ELP融合表达载体,将重组载体 pELP-P54、pP54-ELP、pELP-B602L 和 pB602L-ELP 转化大肠杆菌,用 IPTG 诱导融合蛋白表达,结果显示P54-ELP和B602L-ELP融合蛋白不能表达,ELP-P54和ELP-B602L融合蛋白能有效表达。ELP-P54和ELP-B602L融合蛋白的相变温度分别为28℃和26℃。在0.5%Triton X-100和2mol/L氯化钠存在条件下,相变循环纯化的ELP-P54融合蛋白纯度大于90%,ELP-B602L融合蛋白纯度大于85%。用TEV蛋白酶活性包涵体切除融合蛋白的ELP标签,结果显示切割效率均大于95%,回收的无标签重组p54和B602L蛋白纯度大于90%。免疫转印试验显示无标签重组p54和B602L蛋白能被ASFV抗体阳性血清识别。分别以不同浓度重组p54和B602L蛋白为包被抗原,与不同稀释倍数ASFV抗体阳性和阴性血清进行ELISA反应,结果显示与抗体阴性血清反应阴性,与抗体阳性血清反应阳性,OD450值与血清稀释倍数呈良好的线性关系。用重组p54、B602L抗原与本课题组制备的无标签重组K205R抗原建立混合抗原ELISA方法,对47份ASFV感染存活猪血清进行检测,结果显示45份为ASFV抗体检测阳性,与p54抗原胶体金试纸条检测结果一致,检测敏感性为96%。用Ingenasa公司ELISA试剂盒对47份猪血清进行检测,结果显示23份血清为ASFV抗体检测阳性,4份为可疑,检测敏感性为49%。这些研究资料表明ASFV无标签重组p54和B602L抗原可以用于ASFV抗体检测。
【图文】：

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【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.651

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本文编号：2634092