绵羊抗菌肽GNLY基因多态性分析及合成多肽对小鼠乳房炎模型治疗作用的研究

发布时间：2020-04-20 05:09

【摘要】：抗菌肽是一种广泛存在于生物体内的多肽,其分子量小、化学性质稳定。抗菌肽具有高效的抗细菌、抗肿瘤、抗真菌、抗寄生虫、抗病毒作用,其独特的作用机制使细菌不易产生耐药性,因而成为科学家关注热点。颗粒溶素(Granulysin,GNLY)和大多数抗菌肽一样,能够杀灭多种微生物以及寄生虫,参与机体内免疫应答,是机体天然免疫的重要组成。有关绵羊抗菌肽GNLY研究内容较少,其基因在不同品种绵羊中是否存在差异尚不确定。目的:为了分析不同品种绵羊抗菌肽GNLY基因的SNP多态性,对新疆地区萨福克羊、美利奴羊、湖羊三个品种GNLY基因CDS区测序,利用生物信息学方法预测GNLY二级结构,推测氨基酸序列变化与蛋白结构和功能的关系;人工合成几条基于GNLY基因的多肽,测定合成多肽体外抑菌等生物学活性;挑选体外活性较强的多肽对小鼠乳房炎模型的进行治疗,测定合成多肽在体内的作用,为研发动物用抗感染药物提供科学依据。方法:(1)、通过采集萨福克羊、美利奴羊、湖羊外周血并提取RNA,反转录为cDNA后进行PCR扩增,对PCR产物进行测序分析。利用GNLY核苷酸序列推导出的氨基酸序列,再运用软件分析预测GNLY的二级结构,根据绵羊颗粒溶素GNLY和其单核苷酸多态性基因的推导的氨基酸序列设计多肽,按照保留其两亲性的a-螺旋和LOOP结构的设计原则,选取不同长度的多肽序列,设计合成多肽G16、G22、GS16、GC16。(2)、通过径向扩散试验和MIC试验检测合成多肽对大肠杆菌、沙门氏杆菌、葡萄球菌、金黄色葡萄球菌的抑制作用;利用MTT试验观察合成多肽对人食管癌细胞(EC109)、人肾癌细胞(X786-0)的抑制作用。(3)、通过兔红细胞溶血试验验证合成多肽GC16的毒性;取分娩后8-10天的昆明系小鼠随机等量分为4组,分别记为PBS对照组(即不治疗)、多肽GC16治疗组、抗生素AMP治疗组、空白对照组。除空白对照组,其余每只小鼠均注射金黄色葡萄球菌,8 h后分别用PBS、GC16、AMP进行治疗。24 h后全部脱颈处死,取部分组织做病理切片观察,其余组织做CFU计数和TNF-α检测。结果:(1)、绵羊GNLY的二级结构含有8个α-螺旋和6个LOOP结构;根据测序结果分析,GNLY基因在萨福克羊、美利奴羊、湖羊体内核苷酸序列、氨基酸序列略有差异,与Genbank序列核苷酸同源性为91.85%、93.78%、92.35%,氨基酸同源性为93.15%、93.68%、92.47%。(2)、MIC试验中浓度大于250μg/m L的G16对大肠杆菌、葡萄球菌有抑制作用;浓度大于15μg/m L的GS16对大肠杆菌抑制作用明显,但对沙门氏杆菌、葡萄球菌以及金黄色葡萄球菌无明显的抑菌效果;浓度为62.5μg/mL的GC16对四种细菌均有抑制作用,其中,对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果较为突出;而G22对四种细菌均无显著的抗菌效果;MTT试验结果表明合成多肽G16、GS16对癌细胞无抑制作用,G22和GC16对人食管癌细胞(EC109)、人肾癌细胞(X786-0)具有显著抑制作用,其中1 mg/mL G22和1 mg/mL GC16对EC109生长抑制率分别为88.21%,57.21%,对X786-0生长抑制率分别为96.37%和81.87%。(3)、溶血试验可知多肽对兔红细胞几乎没有毒性;动物试验中,观察PBS治疗组病理切片发现有炎性细胞浸润、充血、出血,腺泡组织不完整,组织间隙有大量细胞团块,金黄色葡萄球菌CFU计数和TNF-α水平明显高于其他3组(P0.05);多肽治疗组和抗生素治疗组没有明显的病理变化,乳腺中含有少量乳汁,乳腺上皮细胞及脂肪细胞正常,间质中偶见个别淋巴细胞,乳腺组织结构基本完整,但是多肽治疗组CFU计数和TNF-α显著低于抗生素组(P0.05)。结论:研究显示GNLY基因在不同品种绵羊中存在丰富的多态性,预测其二级结构含有8个α-螺旋和6个LOOP结构;合成GNLY多肽在体外试验中对细菌和肿瘤细胞具有抑制活性,对小鼠乳腺炎模型治疗具有良好的效果,本研究为绵羊抗菌肽GNLY作为备选抑菌药物的研发打下了基础。
【图文】：

萨福克羊,后产物,电泳,乳房炎

NLY 基因多态性分析及合成多肽对小鼠乳房炎模型治疗拔起，把琼脂糖凝胶连带电泳板转移至电泳槽中L PCR 产物，120 V，50 mA 电泳 30 min。照，并把剩余 PCR 产物送至上海生工进行测序。泳结果萨福克绵羊 GNLY 电泳结果，图 1-2 表示的是美是湖羊 GNLY 电泳结果，电泳结果均在 460 bp 生物工程技术服务有限公司进行 DNA 双向测序绵羊 GNLY 基因序列完全相符。因此，，该 PCR果 466 bp 相同。

电泳图,湖羊,电泳,美利奴羊

图 1-2 美利奴绵羊 GNLY 电泳结果Figure1-2 Production of PCR of Merino Sheep注：1-12：美利奴羊 PCR 后产物 M：Marker ⅠPS：1-12：Production of PCR M：Marker ⅠM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12bpbpbp bp bpbp4
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S859.79

【参考文献】