Txnip在葡萄糖和维生素D调控猪前体脂肪细胞分化中的作用研究

发布时间：2020-04-20 17:41

【摘要】：肉用动物脂肪组织的分布和甘油三酯沉积是影响肉质风味和胴体品质的重要因素。脂肪形成受多种因素影响,其中葡萄糖和维生素D是调控脂肪形成的2种重要营养物质。葡萄糖是猪脂肪合成的主要前体物质,也通过其代谢中间产物促进转录因子碳水化合物反应元件结合蛋白(carbohydrate response element binding protein,ChREBP)表达和诱导其反式激活活性,促进脂肪形成;维生素D在脂肪组织储存及代谢,对脂肪形成产生明显影响。硫氧还蛋白互作蛋白(thioredoxin interacting protein,Txnip)作为氧化还原调节蛋白质,通过与硫氧还蛋白结合并抑制其活性,调节细胞氧化还原状态,影响葡萄糖和脂质稳态及脂肪形成等多种细胞生理过程。然而,在葡萄糖和维生素D调控猪脂肪细胞分化过程中Txnip的作用尚不清楚。因此,本文通过构建靶向猪Txnip基因的siRNA和过表达慢病毒表达载体,转染原代培养猪皮下前体脂肪细胞,分别用葡萄糖和1,25(OH)_2VD_3处理,研究葡萄糖和1,25(OH)_2VD_3对猪脂肪细胞分化的影响及Txnip的作用,为阐明猪脂肪形成的营养机制提供理论依据。1.Txnip siRNA表达载体和过表达载体构建构建了3对靶向猪Txnip基因的慢病毒表达质粒Txnip-shRNA,转染猪前体脂肪细胞后,转染率达90%以上,其中1对(Txnip-shRNA-2)Txnip沉默率达75%(P0.01);构建了猪Txnip过表达慢病毒表达质粒LV5-Txnip,转染猪前体脂肪细胞后,转染率达90%,Txnip表达显著提高(P0.01)。2.1,25(OH)_2VD_3对猪前体脂肪细胞增殖分化的影响以1×10~(-10)~1×10~-77 mol/L浓度1,25(OH)2VD3处理猪前体脂肪细胞,分别用MTT法和油红O染色提取法检测细胞增殖和分化。结果显示,与未处理的对照组相比,1,25(OH)_2VD_3浓度为1×10~-99 mol/L和1×10~-1010 mol/L时,促进猪前体脂肪细胞的增殖,抑制其分化(P0.05);浓度为1×10~-88 mol/L和1×10~-77 mol/L时,抑制猪前体脂肪细胞增殖,促进分化(P0.01);而当1,25(OH)_2VD_3浓度达1×10~(-6)mol/L时,细胞大量漂浮死亡或凋亡。3.Txnip对猪前体脂肪细胞分化的影响分别以Txnip-shRNA和Txnip过表达慢病毒转染猪前体脂肪细胞,分别用油红O染色提取法和实时荧光PCR检测细胞分化及成脂分化关键基因PPARγ、标志基因FAS mRNA表达。Txnip表达沉默后,猪前体脂肪细胞分化、PPARγ和FAS mRNA表达均显著提高(P0.05),而过表达Txnip细胞的分化、PPARγ和FAS mRNA表达显著降低(P0.05),说明Txnip可通过下调PPARγ表达抑制猪前体脂肪细胞分化。4.Txnip在1,25(OH)_2VD_3抑制猪前体脂肪细胞分化中的作用以低浓度1,25(OH)_2VD_3(1×10~-1010 mol/L)处理转染Txnip-shRNA慢病毒表达质粒和未转染的猪前体脂肪细胞,检测细胞分化及成脂基因表达。1,25(OH)_2VD_3处理未转染的对照细胞,细胞分化及FAS、PPARγ和ERK1/2 mRNA表达显著降低(P(27)0.05),而Txnip表达水平显著提高(P(27)0.01)。与未转染细胞相比,Txnip表达沉默显著促进了细胞分化、提高了ChREBP、FAS、PPARγ和ERK1/2表达(P(27)0.01),以1,25(OH)_2VD_3处理后,ChREBP mRNA表达没有显著变化,但FAS、PPARγ及ERK1/2表达显著降低(P(27)0.01)。5.葡萄糖诱导猪脂肪细胞分化中Txnip的作用15 mmol/L的高浓度葡萄糖显著促进猪前体脂肪细胞分化(P0.05);无糖条件下,Txnip表达沉默或Txnip过表达对细胞分化没有显著影响;以葡萄糖处理Txnip表达沉默细胞,细胞分化水平显著提高(P0.05),并显著高于高糖处理的非转染对照组细胞(P0.05);葡萄糖处理后,Txnip过表达细胞的分化显著低于未转染细胞(P0.05),即Txnip过表达减弱了葡萄糖对脂肪细胞分化的促进作用。综上所述,低浓度1,25(OH)_2D_3促进猪前体脂肪细胞增殖、抑制分化,高浓度1,25(OH)_2D_3抑制增殖而促进分化,维生素D对猪前体脂肪细胞增殖和分化具有明显的双向作用。Txnip通过下调PPARγ表达,抑制猪前体脂肪细胞分化,但其作用依赖于葡萄糖的存在;低浓度1,25(OH)_2VD_3可能通过诱导Txnip表达从而下调PPARγ抑制猪前体脂肪细胞分化。葡萄糖促进猪前体脂肪细胞分化,而Txnip减弱葡萄糖对脂肪细胞分化的这种促进作用。
【图文】：

细胞培养,猪脂肪细胞,前体脂肪细胞,标尺

图 1-1 猪前体脂肪细胞形态学观察A：细胞培养 4 h；B：细胞培养 1 d；C：细胞培养 2 d；D：细胞培养 4 d；E：细胞培养 7 d；F：猪脂肪细胞 Bodipy 染色（7 d）；标尺为 200 μmFig.1-1 The morphological analyses of porcine preadipocyte cellsA: Porcine preadipocyte cells cultured for 4 h; B: Porcine preadipocyte cells cultured for 1d ; C:Porcine preadipocyte cells cultured for 2 d; D: Porcine preadipocyte cells cultured for 4 d; E:Porcine preadipocyte cells cultured for 7 d; F: Bodipy staining of porcine preadipocyte cellscultured for 7 d. Scale bar is 200 μm

前体脂肪细胞,显微镜观察,诱导分化,处理组

诱导分化后培养4d的猪前体脂肪细胞A-F依次是以终浓度为对照组、1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7和1×10-6mol/L的1,25(OH)
【学位授予单位】：西北民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S828

【参考文献】