高效表达双基因的重组新城疫病毒的构建

发布时间：2020-04-21 18:26

【摘要】：溶瘤病毒是一类具有复制能力的肿瘤杀伤型病毒;能特异性识别并感染肿瘤细胞;最终导致细胞溶胀而摧毁肿瘤细胞;但无法在正常机体细胞内复制而不具有杀伤作用;理论上具有更高的抗肿瘤效应和更低的副作用。新城疫病毒作为一种新型的病毒载体可以通过表达外源基因来发挥抗肿瘤作用,如通过表达促凋亡蛋白增加肿瘤细胞的凋亡水平、通过抑制先天性免疫反应和增加融合能力来增加病毒复制能力和细胞间传递能力、通过表达肿瘤相关性抗原来激活肿瘤特异性淋巴细胞、通过表达抗肿瘤抗体来激活抗体依赖性细胞调控的细胞毒性反应、通过表达细胞因子来激活和招募淋巴细胞和树突状细胞等。研究发现,利用重组新城疫病毒载体(rNDV)同时表达两种外源基因可以共同调控病毒的溶瘤活性,并且溶瘤活性优于单独表达单个外源基因的效果,此外,外源基因的插入位点影响外源蛋白的表达水平,进而影响重组病毒的抗肿瘤活性。然而,rNDV表达两种外源基因时外源基因插入位点的最佳组合方式尚不清楚。本研究采用rClone30弱毒株为病毒骨架构建了表达单荧光蛋白基因的重组病毒质粒和表达双荧光蛋白基因的重组病毒质粒,通过反向遗传学操作技术平台,拯救了具有感染性的表达单荧光蛋白的重组病毒和表达双荧光蛋白的重组病毒,重组病毒经鉴定和性质测定后转染四种肿瘤细胞,采用免疫荧光实验和流式细胞术检测荧光蛋白的表达水平,通过荧光强度的差异判定外源基因的表达水平,同时探讨rNDV表达两种外源基因时的外源基因插入位点的最佳组合方式。实验结果如下:根据新城疫病毒基因组中位点选择的差异,采用rClone30弱毒株为病毒骨架,通过病毒图谱选择合适的酶切位点,构建了在NP/P位点和/或P/M位点插入外源荧光蛋白基因EGFP或RFP的重组病毒质粒;采用脂质体3000转染试剂摸索转录质粒和辅助质粒的比例,通过反向遗传学操作技术平台,拯救了具有感染性的表达可EGFP和/或RFP的重组病毒;通过提取重组病毒的RNA,采用RT-PCR实验,证实了重组病毒中外源基因的稳定存在;获得的表达单外源基因的重组新城疫病毒包括rClone30-EGFP(NP/P)、rClone30-EGFP(P/M)和rClone30-RFP(P/M),表达双外源基因的重组新城疫病毒包括rClone30-EGFP(NP/P)-RFP(P/M)和rClone30-RFP-EGFP(P/M)。通过重组病毒凝集鸡红细胞、感染鸡成纤维细胞、感染SPF鸡胚和感染雏鸡,采用HA、TCID_(50)、EID_(50)、MDT和ICPI实验证实拯救的重组病毒在病毒滴度,病毒毒力和病毒致病力等指标上仍为弱毒株;通过绘制并比较重组病毒与亲本病毒的生长曲线证实重组病毒与亲本病毒具有相似的生长动力学;结果表明,所构建的5种重组新城疫病毒在生长动力学和分子生物学特性上与亲本病毒无显著差异。体外培养了四种肿瘤细胞HepG2、A549、Hela和U251,将5种重组新城疫病毒分别转染上述四种肿瘤细胞,通过免疫荧光实验和流式细胞术实验检测重组病毒中外源蛋白EGFP蛋白和/或RFP蛋白的表达水平,通过荧光蛋白荧光强度的差异证实在转染的四种肿瘤细胞中重组病毒rClone30-EGFP(NP/P)-RFP(P/M)和rClone30-RFP-EGFP(P/M)中荧光蛋白的表达水平均显著高于rClone30-EGFP(NP/P)、rClone30-EGFP(P/M)和rClone30-RFP(P/M)中的表达水平,而重组病毒rClone30-EGFP(NP/P)-RFP(P/M)中外源荧光蛋白的表达水平高于rClone30-RFP-EGFP(P/M)中的表达;同时发现,所构建的5种重组病毒在肝癌细胞HepG2中外源基因的表达水平均高于相似其他三种细胞(A549、Hela和U251)中的表达水平。结果表明,在外源基因的表达水平上表达双基因的重组病毒优于表达单基因的重组病毒,在外源基因的插入位点上两种外源基因分别插入在NP/P位点和P/M位点时外源蛋白的表达水平最高。如上所述,本研究成功构建并拯救了表达单外源基因和表达双外源基因的重组新城疫病毒;重组新城疫病毒与亲本病毒相比具有相似的生长动力学和生物学特性;确定了rNDV表达两种外源基因时外源基因的最佳插入位点为NP/P位点插入EGFP同时P/M位点插入RFP。本研究为进一步通过有效表达多种外源基因从而增强重组新城疫病毒的抗肿瘤活性研究奠定了基础。
【图文】：

图 1-1 新城疫病毒的基因组结构[4]Fig.1-1 Genome organization of Newcastle disease virus[4]NDV 基因组编码六种结构蛋白，即核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein，NP）、磷酸化蛋白（Phosphate protein，P）、基质蛋白（Matrix Protein，M）、血凝素神经氨酸酶蛋白（Haemagglutinin Neuraminidase protein，HN）、融合蛋白（Fusion protein，F）和依赖性RNA 聚合酶（Large protein，L），，此外，通过 RNA 编辑机制，P 基因可以编码非结构蛋白V 和 W[5]，如图 1-2 所示。根据分布位置不同，新城疫病毒表达的蛋白分为两类，一类为内部蛋白，包括 NP、P 和 L 蛋白，NDV 基因组与这三种蛋白结合形成核糖核蛋白复合体包裹于病毒囊膜内，参与病毒 RNA 的转录和复制；另一类为外部蛋白，包括 M、F 和 HN蛋白，这两种糖基化蛋白 F 和 HN 锚定在病毒囊膜表面上形成大、小纤突，是病毒重要的免疫原成分，参与病毒与受体细胞的吸附和融合作用，而基质蛋白 M 位于病毒囊膜和核衣壳之间，保证病毒结构的完整性[6]。单股负链不分节段的 RNA 病毒在转录时下游区域的基[7]

图 1-2 新城疫病毒的结构蛋白[4]Fig.1-2 The structural protein of Newcastle disease virus[4]新城疫病毒的溶瘤机制新城疫病毒选择性的感染肿瘤细胞，且在肿瘤细胞中复制，并有效地裂解肿瘤细正常细胞没有毒性[8]。病毒的 HN 蛋白可以识别肿瘤细胞表面的受体（唾液酸糖脂）吸附到宿主细胞表面，进一步使 F 蛋白的构象发生变化，促使病毒与细胞膜用[9]。由于在肿瘤细胞中抗病毒信号通路、I 型干扰素信号通路和凋亡信号通路的 Ras 信号的激活和 Rac1 蛋白的表达，使病毒可以在肿瘤细胞中大量复制[10]。作生物制剂的 NDV 可以分为溶瘤株和非溶瘤株，NDV 溶瘤株在肿瘤细胞中复制肿瘤细胞本身的转录和翻译机制，使肿瘤细胞表达受阻，代谢紊乱；还可以导致胞之间发生融合，产生不能存活的合胞体，引起肿瘤细胞的快速、大量死亡；而瘤株产生的新生病毒颗粒包含的 F 蛋白是无活性的形式，在肿瘤细胞中只进行单
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.65

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本文编号：2635563