梅花鹿鹿茸组织PTN基因的克隆及真核表达

发布时间：2020-04-23 15:40

【摘要】：PTN(pleiotrophin)是1989年从牛子宫中发现并提纯的一种生长因子,与肝素具有较高的亲和性。随着研究的不断深入,发现该因子分布广泛且具有多重生物活性,故而后期重新命名为多效生长因子。PTN是一个拥有168个氨基酸的蛋白,包含32个氨基酸残基组成的信号肽,在不同种属间高度保守。现有研究表明PTN在癌细胞增殖中也扮演着重要角色。鹿茸再生以及神奇的增殖速度是自然界非常罕见的,因此也成为科学研究的热点,有相关学者认为鹿茸角再生机制是再生生物学研究的理想模型,并且对鹿茸角增殖机理的研究也有可能成为癌症治疗新的突破点。本试验根据Genbank中同源物种牛的基因序列设计了 PTN基因带酶切位点的同源引物。采用RT-PCR技术、分子克隆技术成功获得梅花鹿鹿茸组织PTN基因cDNA序列,通过对测序结果进行核苷酸和氨基酸序列比对发现,PTN基因cDNA序列长750bp,共编码168个氨基酸,经NCBI中Blast功能比对,结果显示梅花鹿PTN基因与白尾鹿、牛、绵羊同源性较高,核酸序列分别为98%、97%、96%,证明该基因在进化上相对比较保守,符合功能基因特点。运用MEGA5.0构建系统进化树显示梅花鹿与白尾鹿、牛、绵羊等偶蹄目动物进化关系较近,与人、普氏野马、北非果蝠亲缘关系较远,这一进化特点也符合经典分类学观点,从侧面反映了本研究结果的可靠性。Real-time PCR 检测 PTN 基因在鹿茸间充质组织不同时期的相对表达量,结果显示中期表达量比前期和后期都高。将pMD-18T-PTN菌液活化后提取质粒,经双酶切后与同样经过双酶切的真核表达载体pEGFP-C1连接,构建重组质粒转化到DH5α细胞中,经PCR和双酶切鉴定分析,成功构建pEGFP-C1-PTN真核表达载体。将其瞬时转染到复苏培养传代2次生长良好的293T细胞中,荧光显微镜下观察到绿色荧光,证明转染成功。对实验组和对照组细胞同时进行RNA提取,通过Real-time PCR检测发现,PTN在实验组的表达量是对照组的约16倍,说明pEGFP-C1-PTN真核表达载体在293T细胞里成功表达。Real-time PCR检测发现当梅花鹿PTN基因在293T细胞中过表达时,HOXA5、MMP3、MMP10 mRNA表达水平均显著下降,EGF基因mRNA表达水平有显著上调。
【图文】：

中ＰＴＮ浓度明显高于正常对照，，从几十到几百增高倍数不等；在脑胶质细胞瘤、肝细逡逑胞癌、喉淲癌和胰腺癌等不同部位的恶性肿瘤中ＰＴＮ基因表达同样均明显高于正常对逡逑照［３５］。如图１－２ＰＴＮ基因在癌组织与正常组织中的表达丰度图可见，ＰＴＮ基因在多种癌逡逑组织中过量表达，而在正常组织中表达较少甚至不表达，例如皮肤黑色素瘤Ｓｋｉｎ逡逑Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ邋Ｍｅｌａｎｏｍａ（ＳＫＣＭ）中ＰＴＮ的表达量是正常组织中的８００多倍，在嗜铬细胞瘤逡逑和副神经节瘤Ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ邋ａｎｄ邋Ｐａｒａｇａｎｇｌｉｏｍａ（ＰＣＰＧ）中是近２５倍，而在脑低级神逡逑经胶质瘤Ｂｒａｉｎ邋Ｌｏｗｅｒ邋Ｇｒａｄｅ邋Ｇｌｉｏｍａ（ＬＧＧ）中ＰＴＮ的表达平均值为７４８３．７６，在正常组织逡逑中却没有表达。研宄还发现，外源性ＰＴＮ基因的导入能够使ＮＩＨ３Ｔ３细胞和ＳＷ１３细逡逑胞发生恶性转化，而能够表达ＰＴＮ基因的细胞可以在软琼脂上产生克隆自主生长［３６］。逡逑在神经母细胞瘤中，ＰＴＮ基因及其受体的表达量与细胞恶性程度呈正相关［３７］。这些都提逡逑示ＰＴＮ基因是与恶性肿瘤细胞的形成和生长广泛相关的调控基因

、逡逑＿．＾邋—－？￣邋＇ｃ逡逑图１－１邋ＰＴＮ的多种生物功能［３４］逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋ｖａｒｉｏｕｓ邋ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ邋ｏｆＰＴＮ逡逑１．２．２邋ＰＴＮ与肿瘤的相关性逡逑研宄人员在近些年对多种肿瘤的研宄中发现，在胃癌、胰腺癌、结肠癌患者的血清逡逑中ＰＴＮ浓度明显高于正常对照，从几十到几百增高倍数不等；在脑胶质细胞瘤、肝细逡逑胞癌、喉淲癌和胰腺癌等不同部位的恶性肿瘤中ＰＴＮ基因表达同样均明显高于正常对逡逑照［３５］。如图１－２ＰＴＮ基因在癌组织与正常组织中的表达丰度图可见，ＰＴＮ基因在多种癌逡逑组织中过量表达，而在正常组织中表达较少甚至不表达，例如皮肤黑色素瘤Ｓｋｉｎ逡逑Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ邋Ｍｅｌａｎｏｍａ（ＳＫＣＭ）中ＰＴＮ的表达量是正常组织中的８００多倍，在嗜铬细胞瘤逡逑和副神经节瘤Ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ邋ａｎｄ邋Ｐａｒａｇａｎｇｌｉｏｍａ（ＰＣＰＧ）中是近２５倍，而在脑低级神逡逑经胶质瘤Ｂｒａｉｎ邋Ｌｏｗｅｒ邋Ｇｒａｄｅ邋Ｇｌｉｏｍａ（ＬＧＧ）中ＰＴＮ的表达平均值为７４８３．７６，在正常组织逡逑中却没有表达。研宄还发现
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S825

【参考文献】

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本文编号：2637889