HD11细胞感染H9N2 AIV与LPS刺激后mRNA表达谱及炎症信号通路的变化

发布时间：2020-04-23 17:30

【摘要】：H9N2亚型禽流感病毒(Avain influenza virus,AIV)在全世界广泛分布,鸡感染H9N2 AIV后易继发大肠杆菌病,这是我国养禽业普遍面临的难题之一。目前,关于H9N2 AIV感染后继发大肠杆菌病的机制还不清楚。近年来,转录组测序(RNA-Seq)技术已广泛应用于病毒感染宿主细胞的发病机制研究中。本研究利用RNA-Seq技术检测了H9N2 AIV感染与脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)刺激鸡巨噬细胞(HD11细胞)mRNA表达谱的变化,筛选到与炎症相关的基因,进一步阐明其与炎症信号通路的相互关系。具体研究内容如下:(1)H9N2 AIV与LPS感染/刺激HD11细胞后转录组分析及验证。试验设置为5组:对照组、H9N2 AIV感染HD11细胞(H9N2组)、H9N2 AIV感染HD11细胞并同时添加LPS对其形成共刺激(共感染组)、H9N2 AIV感染HD11细胞24 h后添加LPS刺激8 h(继发感染组)这五组进行分析及验证。结果发现,继发感染与共感染后出现的细胞病变比单独H9N2 AIV感染明显。继发感染组中NS1蛋白的表达显著高于H9N2组,共感染组NS1蛋白的表达显著低于继发感染组。将上述5组细胞收取RNA样品后进行RNA-Seq。H9N2组、继发感染组与共感染组筛选到的上调基因与下调基因数量不同,其中共感染组筛选到的差异表达基因最多,有447个基因上调,157个基因下调。利用GO和KEGG Pathway对所筛选到的差异基因进行分析,显示这些差异基因主要聚焦于免疫反应、炎症反应及MAPK、NF-κB等信号通路。为了验证RNA-Seq技术的准确性,我们选取6个与炎症相关的基因进行荧光定量PCR(RT-qPCR)验证,包括IFN-α、IL-10、IL-8、TNF-α、IL-12B与CXCL12。结果发现RT-qPCR与RNA-Seq结果基本一致,初步肯定了测序结果的准确性,为下一步对炎症信号通路影响的研究奠定基础。(2)H9N2 AIV与LPS感染/刺激HD11细胞后炎症信号通路的变化。利用免疫印迹方法对MAPK与NF-κB信号通路的关键蛋白进行检测。其中,MAPK通路的三个关键蛋白(p38、JNK、ERK)发生磷酸化,共感染组的磷酸化水平最显著;p65发生磷酸化,IκBα降解,其中共感染组显著降解。表明H9N2 AIV感染与LPS刺激HD11细胞能够激活MAPK与NF-κB信号通路。此外,进一步研究发现,H9N2 AIV感染与LPS刺激HD11细胞后,使用p38抑制剂SB203580作用细胞,IFN-α、IL-10在抑制剂处理前后发生显著变化,表明通过p38通路促进了IFN-α、IL-10的分泌;使用JNK抑制剂SP600125作用细胞,炎症相关基因在处理前后未发生显著变化,表明IFN-α、IL-10、CXCL12、TNF-α与IL-8不通过JNK通路产生;使用ERK抑制剂SCH772984处理细胞,IL-8在处理前后发生显著变化,表明ERK通路抑制IL-8分泌;利用NF-κB抑制剂BAY11-7082处理细胞,IFN-α、IL-10、CXCL12、TNF-α与IL-8在处理前后变化显著,说明通过NF-κB信号通路促进IFN-α、IL-10、CXCL12、TNF-α,而抑制IL-8分泌。阐明IFN-α、IL-8、IL-10、TNF-α、CXCL12、IL-12B与MAPK、NF-κB信号通路的相互关系。综上所述,本研究通过RNA-Seq技术筛选得到了H9N2 AIV与LPS感染/刺激HD11细胞后差异表达的胞内基因,这些差异基因有助于解析H9N2 AIV感染与大肠杆菌感染之间的关系。进一步研究表明,在继发感染与共感染过程中通过MAPK与NF-κB通路对炎症相关基因有调节作用。研究结果对揭示鸡感染H9N2 AIV后继发大肠杆菌病的分子机制提供了有用的实验数据,为临床上制定H9N2 AIV以及继发产生的大肠杆菌感染的防治策略提供一定的科学依据。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S855.3

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