猪血凝性脑脊髓炎病毒间接Elisa抗体检测试剂盒的研制与应用

发布时间：2020-04-24 11:49

【摘要】：猪血凝性脑脊髓炎是由猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcine hmagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)引起的一种急性、传染性疾病,其主要感染幼龄仔猪,成年猪多呈隐形感染。该病的主要临床症状表现为呕吐、腹泻和神经等症状。感染该病毒的仔猪通常会出现两种症状:呕吐消耗型症状和脑脊髓炎型症状。呕吐消耗型的临床症状表现为呕吐、腹泻、吞咽困难,最终由于长期不进食导致消瘦,机体机能衰竭而死亡,病死率在20%-80%之间。对于存活下来的仔猪,后期生长缓慢成为僵猪。脑脊髓炎型是在呕吐消瘦型症状的基础上发展而来的,主要侵袭3周龄以内的仔猪,临床表现为患病仔猪体温上升,同时也伴有呕吐,食欲减退,有明显的神经性症状,例如肌肉震颤、运动失调、后肢僵直或麻痹成犬坐、四肢呈现划水状,对外界环境和声音刺激异常敏感,发病后期出现眼球震颤、无法直立、呼吸困难,进而导致死亡。该型发病时间短,死亡率高,只有少数会转归康复,死亡率达20%-100%。该病自1952年首次在加拿大爆发后,日本、美国、欧洲等地均有感染此病的报道。1986年中国首次报道此病后,PHEV亦有增强趋势,血清学调查发现,目前该病在东北地区多发,并在吉林和辽宁有很高的感染率,所以制定有效的诊断与预防措施刻不容缓。目前对PHEV的检测方法仍然以实验室诊断为主,需要专业的实验仪器并且对检测人员的要求较高。所以建立一种快速、方便、敏感性及特异性强的诊断方法,成为研究人员亟待解决的课题。其中酶联免疫吸附试验最为符合我们诊断的需要。本研究通过对PHEV重组蛋白N的菌液的复苏,参照最佳诱导条件进行纯化并成功获得抗原,建立及优化了Elisa方法,组建了猪血凝性脑脊髓炎病毒结构蛋白N间接抗体检测试剂盒,为今后的血清学调查提供依据。具体内容如下:1 PHEV-N重组抗原蛋白的制备与质量检测参考本实验室优化所得的最佳诱导条件进行诱导,大量制备目的蛋白,随后用His Gravi Trap纯化试剂盒对其进行纯化,并将纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳检测,检测蛋白的纯度及浓度等。试验方法及结果如下:复苏后的菌液按1:100接种到LB液体培养基中,置于37℃的恒温摇床内200rmp摇晃2h后取出,按1:1000的比例加入100m M的IPTG诱导6小时,超声破碎后进行纯化。取纯化后产物进行SDS-PAGE电泳检测,于55k D处观察到有明显的条带,且无杂带,表明纯化后蛋白的纯度较高。取出所得的4批中的3批纯化蛋白进行蛋白浓度检测,测得的平均浓度分别为122.497mg/m L、189.8887mg/m L、155.44257mg/m L。2 Elisa方法的建立及优化用纯化后的重组N蛋白包被Elisa酶标板,建立Elisa方法并进行优化,并与HI方法进行符合率的比较,所得结果如下:抗原的最佳包被浓度为0.0625μg/m L,血清的最佳稀释度为1:200,最佳抗原包被时间为37℃2h+4℃过夜,最佳封闭剂为3%的脱脂奶,最佳封闭时间为37℃作用2h,血清最佳作用时间为90min,酶标二抗最佳稀释倍数为1:10000,酶标二抗最佳反应时间为37℃作用90min,底物的最佳反应时间是室温作用20min。随后根据统计学原理计算得出当血清OD450nm的值大于等于0.386判定为阳性,当OD450nm的值小于0.320时判定为阴性,介于二者之间为可疑。用建立好的Elisa方法同时检测PHEV、猪δ冠状病毒(PDCo V)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的阳性血清,所得结果显示除PHEV外其他病毒的血清均为阴性,表明本试验特异性良好,无交叉反应。同时对其敏感度进行测定,结果表明当标准阳性血清倍比稀释到1:6400时,检测结果仍为阳性,说明该方法敏感性良好。最后比较Elisa和HI方法二者的符合率为77.5%,结果也表明Elisa方法较HI方法敏感。3猪血凝性脑脊髓炎病毒间接Elisa抗体检测试剂盒的研制及应用在建立的Elisa方法基础上,确定阴阳性对照血清,用纯化后的重组蛋白制备酶标板,组建3批Elisa抗体检测试剂盒,对其批内、批间重复性、保存期、敏感性、特异性等条件进行检测,最后应用于临床样本的检测。具体结果如下:对3批试剂盒进行批间和批内的测定实验,发现不同批次组装的试剂盒,变异系数在3.43%-7.56%,均小于10%。三批组装的试剂盒,随机检测4份不同抗体效价的血清,变异系数在1.09%-2.60%,均小于3%,表明试剂盒的批间和批内检测结果稳定,重复性好。分别对三批试剂进行敏感性测定结果发现在血清稀释度在1:6400时仍为阳性,随后检测PHEV、猪δ冠状病毒(PDCo V)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒(PCV)这5种病原的阳性血清,发现除PHEV外,其他猪病的血清均为阴性。同时对试剂盒的保存期进行测试,发现该试剂盒在-20℃可以保存6个月。最后用已组装好的猪血凝脑脊髓炎病毒间接Elisa抗体检测试剂盒分别对采集自山东、吉林、辽宁、天津等地633份血清进行检测,调查发现各地阳性血清比例均占半数以上。综上所述,本研发项目初步建立了PHEV抗体检测试剂盒,且该试剂盒具有较高的敏感性、特异性和重复性,可用于PHEV免疫抗体的检测与流行病学调查。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.28

【参考文献】